恩施鲊廣椒乳酸菌的分離鑒定及其對揮發(fā)性風味物質的影響

雷 炎，馬佳佳，雷 敏，趙 楠，郭 壯，3，張振東，趙慧君*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；

2.四川省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；

3.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

鲊廣椒也稱為鲊尖椒、鲊金椒、酸面、面果子，是湖北宜昌、恩施地區(qū)漢族、土家族的特色發(fā)酵食品。鲊廣椒是以鮮紅辣椒醬和苞谷面（玉米面）為主要原料加工而成的，具有營養(yǎng)全面、開胃爽口的特點，適合人們養(yǎng)生所用。乳酸菌（lactic acidbacteria，LAB）是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1]。目前，主要通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)法對發(fā)酵食品中的乳酸菌進行研究，CHEN Y S[2-7]等已從臺灣腌桃子、印度泡菜、辣白菜、四川泡菜中成功分離出大量的乳酸菌。

電子鼻又稱氣味掃描儀，電子鼻技術是以特定的傳感器模擬人類嗅覺感官系統(tǒng)，快速提供被測樣品的整體信息，從而指示樣品中隱含特征的技術[8]。電子鼻技術是新興的無損檢測方法之一，隨著科學技術的不斷進步，電子鼻技術的研究越來越趨于完善，其已廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)的各個部門。FAN Y等[9]利用電子鼻技術分析了中國傳統(tǒng)蝦醬中的特色風味物質；LIN X等[10]利用電子鼻技術研究了4個不同酵母株系對蘋果酒風味物質的影響。

目前，關于鲊廣椒中乳酸菌及其對鲊廣椒揮發(fā)性風味物質的影響的研究還很少。因此，本研究對恩施鲊廣椒中的乳酸菌進行分離純化，采用分子生物學技術對其進行鑒定；然后將優(yōu)勢乳酸菌應用于鲊廣椒，并利用電子鼻技術研究不同乳酸菌對鲊廣椒中揮發(fā)性物質的影響，為鲊廣椒的研究提供基礎的依據(jù)，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）篩選出適合鲊廣椒發(fā)酵的乳酸菌菌種，為鲊廣椒的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒樣品：采集自湖北恩施的農(nóng)戶家中，采集后的樣品放入采樣箱中低溫保存。

玉米粉、紅辣椒、鹽、花椒、白胡椒和白酒：市售；MRS瓊脂（液體）培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；Axygen聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：康寧生命科學吳江有限公司；DL15000Marker、DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、pMD18-T克隆載體：寶生物工程（大連）有限公司；引物M13F（-47）、M13R（-48）、27F和1492R：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PTC-100 PCR儀：美國ABI公司；Fluor Chem FC3化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；DG250厭氧工作站：英國Don Whitley公司；PEN3電子鼻（配備W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S10個金屬氧化傳感器）：德國Airsense公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離

采用稀釋涂布平板法[11]對乳酸菌進行分離，取10-4、10-5、10-6三個梯度的稀釋液涂布于含1.5%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，于厭氧工作站30℃培養(yǎng)48h。挑取菌落形態(tài)不同和透明圈明顯的單菌落純化3次，純化后的菌株進行革蘭氏染色[12]與過氧化氫酶實驗，初步確認其為乳酸菌后保存于-80℃冰箱中。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

將初步確認為乳酸菌的菌株從-80℃冰箱中取出活化，收集菌體，采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammoniumbromide，CTAB）法[13]提取DNA。以此為模板，采用引物27F（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）對細菌的16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增體系[14]（25 μL）：DNA模板1 μL，rTaq酶0.5 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ri bonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL，5 μmol/L27F0.5 μL，5 μmol/L 1495R 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，用雙蒸水（ddH2O）將體系補充至25 μL。PCR擴增條件：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，對符合目的片段大小的PCR擴增產(chǎn)物進行清潔并與pMD18-T載體進行連接，轉化到大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10中，利用引物M13F（-47）（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）和M13R（-48）（5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′）鑒定陽性克隆子，將陽性克隆子送往武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。測序結果去除引物序列后在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA序列，采用MEGA5軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 鲊廣椒的制作

選取鲊廣椒中的優(yōu)勢菌株進行鲊廣椒的制作。將菌株從-80℃取出，取50μL菌液注入150mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)24 h，進行第1代活化，連續(xù)活化3代后，10 000 r/min離心5 min，去除上清后加入45 mL生理鹽水重懸菌體待用。

取750g玉米粉，225g切碎的紅辣椒（手工切碎3～5mm寬度），3.15 g粉碎的花椒、胡椒，45 mL待用菌液（對照組加入等量的生理鹽水），混合均勻，裝入壇中，用水封口后于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵20 d。鲊廣椒發(fā)酵完成后，取300 g樣品裝入樣品瓶中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 基于電子鼻技術恩施鲊廣椒風味品質的評價

取10 g鲊廣椒樣品置于電子鼻樣品瓶中，室溫下平衡30min，采用電子鼻技術對揮發(fā)性物質進行檢測。電子鼻參數(shù)：進樣吸氣流量200mL/min，傳感器清潔時間90s，調(diào)零時間5s，測定時間60s，每隔1s測量1個響應值。電子鼻有10個金屬氧化傳感器，每個傳感器與其對應的敏感物質如表1所示[15]。

表1 金屬傳感器及其對應的性能描述Table 1 Description of metal sensors and its corresponding performance

1.3.5統(tǒng)計學分析

利用The SAS V8和Origin 2017進行電子鼻統(tǒng)計分析。使用主成分分析（PCA）對加入不同乳酸菌的鲊廣椒的風味進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

采用稀釋涂布平板法從恩施地區(qū)鲊廣椒樣品中共分離純化出15株乳酸菌，編號為HBUAS51131、HBUAS51132、HBUAS51133、HBUAS51134、HBUAS51135、HBUAS51136、HBUAS51137、HBUAS51141、HBUAS51142、HBUAS51143、HBUAS51144、HBUAS51145、HBUAS51146、HBUAS51147、HBUAS51148。

2.2 菌株的鑒定

采用CTAB法提取15株乳酸菌的DNA，結果如圖1所示。由圖1可知，各菌株基因組DNA均在15 000 bp之上，且條帶清晰明亮，證明提取的DNA可用于乳酸菌16S rDNA基因序列擴增[16]。

圖1 乳酸菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of lactic acid bacteriagenomic DNA

圖2 乳酸菌16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of PCR amplification products of lactic acid bacteria 16S rDNA

15株乳酸菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。由圖2可知，各泳道在1 500 bp左右都出現(xiàn)了一條明顯的亮帶，證明各菌株目標片段均被成功擴增。用清潔試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行清潔，克隆后挑選陽性克隆子送往武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。

測序后所得序列進行拼接，在NCBI上進行同源性比對，15株乳酸菌16S rDNA序列同源性比對分析結果見表2。有文獻報道[17]，與模式菌株相比，同源性＞98.65%的細菌被判定為同種。由表2可知，恩施地區(qū)鲊廣椒的15株乳酸菌與其對應的模式菌株同源性均≥99%，表明乳酸菌均已鑒定到種的水平。

表2 乳酸菌16S rDNA序列同源性比對結果Table 2 Homology alignment results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria

選取同源性較高的模式菌株，采用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3所示。由圖3可知，菌株HUBAS51131、HUBAS51132、HUBAS51133、HUBAS51134、HUBAS51135、HUBAS51136、HUBAS51141、HUBAS51145、HUBAS51146和HUBAS51147 10株乳酸菌與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，同源性≥99%，親緣關系最近，因此鑒定這10株乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；菌株HBUAS51142、HBUAS51144和HBUAS51148 3株乳酸菌與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）聚于一支，同源性≥99%，親緣關系最近，因此鑒定這3株乳酸菌為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）；菌株HBUAS51137與副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）聚于一支，同源性≥99%，親緣關系最近，因此鑒定其為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）；菌株HBUAS51143與食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）聚于一支，同源性≥99%，親緣關系最近，因此鑒定其為食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）。由此可推斷，L.plantarum為恩施鲊廣椒中的優(yōu)勢菌，占分離菌株總數(shù)的66.67%。與王玉榮等[18-19]對當陽地區(qū)鲊廣椒中細菌多樣性的研究結果相似，Lactobacillus屬是優(yōu)勢菌屬。

圖3 基于16S rDNA序列乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequences

2.3 基于電子鼻技術恩施鲊廣椒風味品質的評價

電子鼻有10根傳感器，不同時間鲊廣椒的電子鼻傳感器響應值如圖4所示。由圖4可知，不同傳感器對鲊廣椒呈現(xiàn)不同的響應，W1W對鲊廣椒的響應值最高，W1S、W5S、W2S和W2W響應值次之，W2S、W6S、W3C、W5C和W1C響應值偏低。隨著檢測時間的延長，傳感器W1C（對芳香類物質靈敏）、W3C（對氨氣、芳香類物質靈敏）和W5C（對烷烴、芳香類物質靈敏）的響應值呈下降趨勢，傳感器W1W（對有機硫化物、萜類物質靈敏）和W1S（對甲烷靈敏）響應值呈明顯的上升趨勢。結果表明，鲊廣椒中揮發(fā)性風味物質有機硫化物、萜類物質以及甲烷等含量可能較高，芳香類揮發(fā)性風味物質的含量可能較低。鲊廣椒的信號強度在45～55s趨于平穩(wěn)，選取49 s、50 s、51 s的測量數(shù)據(jù)作為參考值，取3個數(shù)據(jù)的平均值進行PCA。

PCA是將提取的傳感器響應值信號進行數(shù)據(jù)轉換和降維，對降維后的特征向量進行線性分類，PC1和PC2上包含了在PCA轉換中得到的第一主成分和第二主成分的方差貢獻率。方差貢獻率越大，說明此主要成分可以較好地反映原來多指標的信息[20]。一般情況下，總貢獻率超過70%～80%的方法即可使用[21]。對于一個具有多個變量的全局函數(shù)來說，因子圖分析法具有很大的通用性。基于電子鼻技術PC1和PC2的因子載荷圖如圖5所示。

圖4 不同時間鲊廣椒的電子鼻傳感器時間-強度動態(tài)響應Fig.4 Time-intensity dynamic response of electronic nose sensor for Zhaguangjiao at different time

圖5 基于主成分分析的因子載荷圖Fig.5 Factor loading diagram based on PCA

由圖5可知，第一主成分貢獻率為83.46%，第二主成分的貢獻率為10.59%，總貢獻率為94.04%，大于80%，說明PC1和PC2已經(jīng)可以較好地反映樣品的整體信息。而且，由于PC1的方差貢獻率為83.46%，所以主要通過橫坐標來反映10個樣品的信息。第一主成分包括W1C、W1W、W6S、W2W、W3S、W2S和W1S；第二主成分包括W2W、W5C、W3C和W5S。基于電子鼻技術PC1和PC2的因子得分圖如圖6所示。

由圖6可知，添加植物乳桿菌組均分布于第一、二、三象限中，對照組則處于第四象限。由此可知，添加植物乳桿菌組與對照組的差異性較大。結合圖5分析可得，與對照組相比，添加植物乳桿菌組的鲊廣椒芳香性物質含量更高，氮氧化物、氫化物、有機硫化合物和烷烴等物質含量顯著降低。結合圖5、圖6分析可知，不同植物乳桿菌對鲊廣椒的影響也存在較為顯著的差異，植物乳桿菌HUBAS51132和HUBAS51141分布于第二象限，芳香類物質含量更高；植物乳桿菌HUBAS51134、HUBAS51147、HUBAS51133和HUBAS51131分布于第一象限，氫氣、乙醇、烷烴、有機硫化物和萜類物質等物質含量更高。由此可見，利用HUBAS51132和HUBAS51141兩株植物乳桿菌制作的鲊廣椒芳香性更好。

圖6 基于主成分分析的因子得分圖Fig.6 Factor scores based on PCA

3 結論

本研究通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法，從湖北恩施地區(qū)采集的15個鲊廣椒樣品中共分離出15株乳酸菌，通過分子生物學技術鑒定10株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、3株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、1株為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、1株為食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），其中L.plantarum占分離菌株總數(shù)的66.67%，為恩施鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌。利用這10株植物乳桿菌制作鲊廣椒，并利用電子鼻及主成分分析（PCA）分析與不添加乳桿菌的鲊廣椒樣品揮發(fā)性風味物質的差異。結果表明，與對照相比，添加L.plantarum的鲊廣椒芳香類物質明顯增多，氮氧化物、氫化物、有機硫化合物和烷烴等物質含量顯著降低，且植物乳桿菌HUBAS51132和HUBAS51141制作的鲊廣椒芳香性更好，在風味上更迎合消費者的喜好。