多糧濃香型白酒生產過程中可培養酵母菌多樣性分析與優質功能菌篩選

崔小亮，邵小兵*，鐘和平，葛 隱，楊 洋，張 賀

（宜賓長江源酒業有限責任公司，四川 宜賓 643000）

酵母菌是白酒生產過程中的主要功能微生物，其在淀粉的糖化、酒精的生成、香氣物質的形成、酒醅的發酵及終產品品質等方面都起著重要的作用[1]。因地域、環境、氣候、工藝等不同，不同香型白酒釀造過程中，酵母菌群種類分布有一定差異。如濃香型白酒酵母菌種類主要有產酯酵母、假絲酵母、釀酒酵母、接合酵母及伊薩酵母等[2-5]；醬香型白酒酵母菌主要有扣囊復膜酵母、異常畢赤酵母、檸檬形接合酵母、東方伊薩酵母及畢赤酵母等[6-8]；清香型白酒酵母菌種類主要有釀酒酵母、漢遜酵母及少量的假絲酵母[9]。

目前，釀酒行業研究的酵母菌主要是從大曲、窖泥、糟醅及環境中分離篩選，根據其特性及主要代謝產物種類將其分為釀酒酵母及產香酵母兩大功能類別[10-11]。其中釀酒酵母糟醅中主要的乙醇產生菌，產酯酵母菌對基酒中主要酯類比例起著主要作用。只有兩類酵母菌具有適當的比例和較高的活性，才能保證糟醅中產乙醇和產酯反應順利進行，同時糟醅中較高的乙醇含量能夠抑制雜菌的過度生長，從而使糟醅酸度控制在適當范圍。但是由于生產管理不當、菌群比例不斷變化等問題導致白酒生產行業長期普遍存在出酒率低、糟醅酸高、基酒主要酯類比例失調等問題，嚴重阻礙了產品質量的進一步提升[12]。

近年來酵母菌在釀酒中的研究主要集中在酵母菌的產酒功能、產酯功能等，同時伴隨著耐酸、耐熱等能力研究[13-14]。本研究從曲藥、糟醅、窖泥、輔料抽取多個樣品，全面分析多糧濃香型白酒生產過程中可培養酵母菌多樣性，基于ITS rDNA序列構建其系統發育樹對其進行鑒定；采用酒精度快速測定儀及氣相色譜-質譜（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS）法分別檢測菌株發酵液乙醇含量及酯含量，借此篩選優質釀酒功能酵母菌，并考察其發酵特性。期望通過對白酒生產過程中酵母菌的研究，為多糧濃香型白酒產質量提高提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從五糧液制曲車間、釀酒車間取樣11個，其中大曲3個、糟醅3個、窖泥3個、輔料2個。

1.1.2 試劑

酵母菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒（B639285）：生工生物工程（上海）股份有限公司；無水葡萄糖（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：天津大茂化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

麥芽汁液體培養基：麥芽汁130.1g，加水定容至1000mL，121℃滅菌20 min，備用。

麥芽汁固體培養基：瓊脂粉20 g，麥芽汁130.1g，加水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，倒平板，備用。

麩皮培養基：5%麩皮煮沸1 h，用紗布過濾掉麩皮后加入葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設備

HZQ-F100搖床、LRH-250恒溫培養箱、HW326恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；DM-500顯微鏡：日本尼康公司；4920 000.016移液槍：德國Eppendorf公司；M367983 PCR擴增儀：美國伯樂公司；Dyy-12電泳儀：北京市六一儀器廠；MOD.Super Alcomat酒精度快速測定儀：意大利GIBERTINI公司；ZF-670凝膠成像系統：上海嘉鵬科技有限公司；6890N-5973氣相色譜-質譜儀：美國安捷倫公司；LD5-2A離心機：北京京立離心機有限公司；SJIA-10N-50A冷凍干燥機：上海秋佐科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分離純化與保藏

稱取5.00 g樣品，倒入裝有50 mL已滅菌麥芽汁液體培養基的錐形瓶中，160～180 r/min、28℃富集培養24 h。按10倍稀釋法對富集液進行梯度稀釋，移取稀釋液0.5 mL均勻涂布于麥芽汁固體培養基上，28℃恒溫倒置培養48～72 h。挑取單菌落在麥芽汁固體培養基上純化1～2次，獲得純化菌株[15]。

純化菌株采用麥芽汁固態培養基斜面培養短時間保存[16]，用冷凍干燥機將菌株冷凍干燥，保護劑為20%甘油，預凍溫度為-80℃，預凍時間為3 h，凍干時間為8 h，菌株干粉在-80℃條件下長期保存。

1.3.2 菌株鑒定

（1）菌株形態觀察

將篩選到的酵母菌接種在麥芽汁固體平板培養基上，28℃恒溫培養2d，觀察并記錄酵母菌株在麥芽汁固體培養基上的菌落及細胞形態。

（2）菌株的分子生物學鑒定

DNA提?。喊凑丈虾Ｉそ湍妇蚪MDNA抽提試劑盒說明書的實驗步驟提取目的菌株的總DNA。

ITS rDNA序列擴增與序列分析：上游引物ITS1：5′CTTggTCATTTAgAggAAgTAA3′；下游引物 ITS4：5′TCCTCCgCTTATTgATATgC3′。PCR擴增體系（50μL）：ddH2O 22 μL，2×PCR master 25 μL，Primer 1 2 μL，Primer 2 2 μL，模板1μL。PCR擴增程序：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72 ℃、1 min，共35個循環，72 ℃、10 min。

擴增的ITS rDNA序列產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果登錄美國國立生物技術信息中心（national center for biotechonology information，NCBI）網站用基本局部比對搜素工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行序列比對，通過MEGA5軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統進化樹。

1.3.3 優質功能酵母菌篩選

將分離到的酵母菌分別接種于麩皮培養基，接種量5%，裝液量250 mL/500 mL，28℃、160～180 r/min條件下搖床培養72 h后，分別用酒精度快速測定儀測定發酵液中乙醇含量[17-18]，用氣相色譜-質譜（GC-MS）法測定發酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯含量[19-20]。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（60m×250μm，0.25 μm）；手動無分流進樣，進樣口溫度230℃；程序升溫：初始溫度40℃，保留1 min，以3℃/min的速率升至180℃，再以2.5℃/min的速率升至230℃，保留10 min；汽化室溫度230℃；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍20～500 u，離子源溫度250℃；接口溫度230℃。

1.3.4 功能酵母菌的發酵特性

將初篩到的4株酵母菌分別接種于麩皮培養基，接種量5%，裝液量250mL/500mL，于溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH值分別為2、3、4、5、6條件下160～180r/min振蕩培養72 h后分別用酒精度快速測定儀測定發酵液中乙醇含量，用氣相色譜-質譜（GC-MS）法測定發酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯含量，考察功能菌株在不同發酵溫度及pH值條件下的發酵特性。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離純化及形態特征

從多糧濃香型白酒生產過程中多次取樣，經過反復分離純化，共分離出43株酵母菌，曲藥中得到15株酵母菌，糟醅中得到17株酵母菌，窖泥中得到7株酵母菌，輔料中得到4株酵母菌。通過麥芽汁培養基上菌落形態特征和菌落散發出的氣味特性，將篩選到的酵母菌分為12種類型，分別編號為WY1（6株，編號為WY1-1～6）、WY2（6株，編號為WY2-1～6）、WY3（2株，編號為WY3-1～2）、WY4（6株，編號為WY4-1～6）、WY5（3株，編號為WY5-1～3）、WY6（5株，編號為WY6-1～5）、WY7（1株，編號為WY7-1）、WY8（2株，編號為WY8-1～2）、WY9（7株，編號為WY9-1～7）、WY10（3株，編號為WY10-1～3）、WY11（1株，編號為WY11-1）、WY12（1株，編號為WY12-1）。12種類型酵母菌的菌落及細胞形態見圖1和表1。

圖1 多糧濃香型白酒生產過程中可培養酵母菌菌落及細胞形態Fig.1 Colony and cell morphology of cultivatable yeast during the production of multi-grain strong-flavorBaijiu

表1 多糧濃香型白酒生產過程中可培養酵母菌菌落及細胞形態特征Table 1 Colony and cell morphological characteristics of cultivatableyeast during the production of multi-grain strong-flavorBaijiu

在分離純化菌株基礎上，通過有效分析多糧濃香型白酒生產過程中可培養酵母菌多樣性，為后續菌株的分子生物學鑒定和優質功能酵母菌篩選奠定基礎。

2.2 酵母菌分子生物學鑒定

在酵母菌菌落形態及細胞形態觀察基礎上，從12種形態類型中各選擇1株綜合特征能夠代表本類酵母菌、長勢健壯的模式菌株，提取其總DNA并進行ITS rDNA基因PCR擴增，結果見圖2。

圖2 酵母菌基于ITS rDNA基因序列PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products based on ITS rDNA gene sequence of yeasts

由圖2可知，12株酵母菌的ITS rDNA基因PCR擴增產物無雜條帶，且均在500～750 bp之間，這與目的DNA序列大小一致，說明引物設計、PCR擴增體系合理，擴增效果比較理想，無需進行純化，可直接送測序公司測序。

測序結果在NCBI上進行Blast比對，用DNAMAN8.0軟件將上述序列與擴增的ITS序列進行序列比對，并輔以人工修剪將開始和末尾處長短不同的序列剪切整齊，基于Kimura雙參數模型，用MEGA5軟件中的鄰接（NJ）法進行系統關系分析并構建系統發育樹，結果見圖3。

圖3 基于ITS rDNA序列構建的多糧濃香型白酒生產過程中可培養酵母菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of cultivable yeasts during the production of multi-grain strong-flavorBaijiubased on ITS rDNA sequences

由圖3可知，系統發育樹共分為8個分支，從上到下依次為第1～8分支，其中菌株WY1和WY3位于第1分支，菌株WY2、WY6和WY9位于第7分支，菌株WY11和WY12位于第8分支，其他篩選菌株與各自模式菌株位于同一分支，系統發育樹的聚類結果與擴增的ITS序列測序結果在NCBI比對的同源性鑒定結果趨于一致。

一般Bootstrap值達到95以上可以判斷二者是同一種，因此本研究系統發育樹前7個分支同一分支上的酵母菌可初步判定為同一種，第8個分支上的酵母菌可以鑒定到屬。結合篩選酵母菌與模式酵母菌的形態和生理特性，篩選到的12種形態類型酵母菌被鑒定為8種酵母菌，具體如下：①菌株WY1和WY3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；②菌株WY2、WY6和WY9為庫德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；③菌株WY11和WY12為羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）；④菌株WY4為海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）；⑤菌株WY7為拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）；⑥菌株WY5為扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）；⑦菌株WY8為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）；⑧菌株WY10為季也蒙畢赤酵母（Galactomyces geotrichum）。

2.3 功能酵母菌篩選

行業內大量研究證明，白酒生產中主要功能酵母菌為假絲酵母、釀酒酵母、接合酵母、嗜殺酵母、伊薩酵母、扣囊復膜酵母、畢赤酵母等[5]。因此結合2.2中鑒定結果，選取菌株WY1和WY3、WY4、WY5、WY2、W6和WY9、WY10共6類酵母菌，探索其乙醇發酵特性和產酯特性。由于每個類別都包含有多個菌株，只列出在每個組別酵母菌中性狀表現較好的菌株，結果見表2。

表2 13株酵母菌發酵液產乙醇和產酯（己酸乙酯和乙酸乙酯）測定結果Table 2 Determination results of ethanol and ester(ethyl caproate and ethyl acetate)production in the fermentation broth of 13 yeasts

由表2可知，菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2發酵液中乙醇含量分別為13%vol、9%vol、9%vol，顯著高于其他菌株乙醇產量，最高可達6.5倍；菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1發酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯總含量分別為438 mg/100 mL、521 mg/100 mL、341 mg/100 mL，顯著高于其他菌株發酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯總含量，最高可達40倍。因此篩選菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2進一步研究發酵溫度和pH值對其乙醇發酵特性的影響；篩選菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1進一步研究發酵溫度和pH值對其產酯特性的影響[21-22]。

2.4 功能酵母菌的發酵性能

研究發酵溫度和pH值對菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2乙醇發酵特性的影響以及對菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1產酯特性的影響，結果見圖4。

由圖4a、4c可知，3株產乙醇特性較好的酵母菌都具有一定的耐酸性，在pH值為3的環境中依然能保持產乙醇能力，發酵結束時，3株菌的發酵液中乙醇含量保持2%vol以上，菌株WY5-1具有較好的溫度適應性，且乙醇產生能力較強。菌株WY3-2在較低溫度條件下具有一定的乙醇產生能力，這兩個菌株可作為強化功能菌株應用于實際生產，有目的性的快速積累大量的乙醇，從而隨著發酵溫度的升高，通過乙醇抑制雜菌的生長。

由圖4b、4d可知，菌株WY4-1、WY6-3、WY9-2這3株菌都具有一定的溫度適應性，在20℃低溫和35℃高溫環境中具有己酸乙酯、乙酸乙酯產生能力，在適宜的溫度環境中，發酵結束時，3株菌的發酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯總含量保持400 mg/100 mL以上，菌株WY9-2產酯能力最強，最高可達552 mg/100 mL，菌株WY6-3次之，但是3株菌的酸度耐受性稍差。

圖4 溫度和pH值對酵母菌發酵液中乙醇和酯含量的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on ethanol and ester contents in the yeast fermentation broth

結合系統發育樹及可培養酵母菌篩選情況，菌株WY6、WY9和WY2三者具有很近的親緣關系，ITS rDNA相似度為99%，且在本研究所篩選酵母菌中占有較高的比例，菌株WY6、WY9和WY2三類酵母菌共有18株菌，占所篩選酵母菌的42%，從而有效解釋濃香型白酒生產中乙酸乙酯偏高的原因。

3 結論

通過ITS序列擴增、測序，并構建系統發育樹，本研究得到的12種形態類型酵母菌被鑒定為8種酵母：菌株WY2、WY6、WY9為庫德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；菌株WY1、WY3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌株WY4為海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）；菌株WY5為扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）；菌株WY7為拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）；菌株WY8為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、菌株WY10為季也蒙畢赤酵母（Galactomyces geotrichum）、菌株WY11、WY12為羅倫隱球酵母（Cryptococcuslaurentii）。

功能酵母菌篩選結果表明，扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）WY5-1和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WY3-2具有良好的產乙醇特性；庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）WY6-3和WY9-2具有良好的產酯特性。菌株WY5-1具有較好的溫度適應性，且乙醇產生能力較強，WY3-2在較低溫度條件下具有一定的乙醇產生能力，在20℃的環境中發酵結束時，發酵液乙醇含量保持4%vol以上。菌株WY4-1、WY6-3、WY9-2這3株菌都具有一定的溫度適應性，但是3株菌的酸度耐受性稍差，菌株WY9-2產酯能力最強，最高可達552 mg/100 mL，菌株WY6-3次之，最高含量為493 mg/100 mL。

本研究最終篩選到2株產乙醇特性較好菌株，扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）WY5-1和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WY3-2；2株產己酸乙酯、乙酸乙酯特性較好的菌株，庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）WY6-3和WY9-2。4株功能酵母菌均具有較好的溫度適應性和一定的酸度耐受性，下一步通過深入研究優化這4株菌的生長特性和代謝產物，并探索不同種類酵母菌的相互作用關系，以期為白酒生產產質進一步提升提供理論基礎。