北冰洋來源白色念珠菌拮抗菌株的分離與鑒定

邱昊旻，劉博超，馬啟晨，王曉彤，權春善，金黎明*，宮小明

（1.大連民族大學 生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116605；

2.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041）

白色念珠菌（Canidia albicans）為念珠菌屬，又稱白假絲酵母菌，是一種酵母樣條件性致病真菌，廣泛存在于自然界，可在健康人和畜禽的口腔、呼吸道、消化道黏膜和腸道等處寄居，當維生素缺乏、營養不良、抵抗力下降、機體內微生態平衡遭到破壞時容易引發疾病[1-2]。目前，白色念珠菌拮抗菌株的篩選來源主要集中于陸地和海洋，其中，海洋微生物由于生存環境具有高鹽、高壓、低溫和稀營養的特點，為了長期適應復雜的海洋環境而生存，可能產生區別于陸生微生物的次生代謝產物，成為近年來研究的熱點[3-12]。王勇勇等[13]從渤海灣不同站位分離獲得的海洋絲狀真菌中篩選獲得4株對野生型白色念珠菌SC5314具有較強抑菌活性的海洋真菌，其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）分別為65 g/mL、19 g/mL、54 g/mL、23 g/mL；ZHANG Y等[14]從褐藻囊藻（Colpomenia sinuosa）中分離到一株對白色念珠菌有較好的抑制效果的海洋真菌黑曲霉（Aspergillus niger）EN-13；WEN L等[15]從臺灣地區紅樹林中分離到一株對白色念珠菌有較好抑制效果的真菌擬青霉屬（Paecilomycessp.）Tree1-7。但關于抑制白色念珠菌的北冰洋來源海洋微生物的研究鮮見報道。

本研究從北冰洋沉積物樣品中篩選能夠抑制白色念珠菌的海洋微生物，采用形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行鑒定，并研究其抑菌譜。為進一步研究其具有抗菌性的次級代謝產物，尋找可能的新的抗菌藥物奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品：中國第六次北極考察的北冰洋沉積物樣品。

1.1.2 指示菌

白色念珠菌（Canidia albicans）SN250、大腸桿菌（Escherichiacoli）CMCC44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）CGMCC1.1616、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CICC 21484、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）BNCC 194496、屎腸球菌（Enterococcus faecium）BNCC 336951、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）BNCC 186113：本實驗室保藏。

1.1.3 主要試劑

聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR）試劑：大連寶生物公司。瓊脂、酵母浸粉、葡萄糖、胰化蛋白胨（均為生化試劑）：奧博星生物技術公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.4 培養基

LB海水培養基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂20 g，氯化鈉10 g，海水1 L，pH 7.0。液體培養基中不加入瓊脂。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH 7.0。

營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2。

腦心浸液肉湯（brainheart infusion broth，BHI）培養基：蛋白胨10 g/L，脫水小牛腦浸粉12.5 g/L，脫水牛心浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖2 g/L，Na2HPO42.5 g/L，pH 7.0。

MRS培養基。以上培養基均在121℃條件下滅菌20min。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DHG-9070A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；MT-180B生化恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 海洋微生物的分離和純化

采用涂布平板法分離海洋微生物菌株[16]。取0.5 g沉積物樣品，加入4.5 mL陳海水，混勻后靜置2 h。采用陳海水10倍梯度稀釋至10-1～10-7，選取稀釋度為10-4～10-7的稀釋液50 μL涂布于LB海水培養基平板。28℃條件下倒置培養1～2 d，獲得單菌落。挑取單菌落，采用平板劃線法純化菌株，并進行編號、保藏。

1.3.2 白色念珠菌拮抗菌株的初篩

采用對峙培養法進行初篩[16]。將白色念珠菌培養液以0.1%（V/V）的接種量加入LB培養基中，搖勻，倒平板，待凝固后，將上述分離純化的菌株劃線于培養基上，置于30℃恒溫培養箱進行培養，觀察是否有抑菌圈，將具有抑菌圈的單菌落作為初篩菌株。

1.3.3 白色念珠菌拮抗菌株的復篩

參考張靜楠等[16]的方法，將初篩獲得的菌株接種于100 mL LB海水液體培養基中，28℃、180 r/min條件下培養3～4d，得到的發酵液在4℃、8000r/min條件下離心10min，取上清液旋蒸濃縮，并將濃縮液經0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，得到5 mL濃縮發酵液。

采用瓊脂擴散法測定濃縮發酵液對白色念珠菌的抑菌活性[16]。將白色念珠菌以0.1%（V/V）的接種量加入LB培養基中，待平板凝固后，用打孔器打直徑為9 mm的孔，每孔加入400 μL濃縮發酵液，37℃培養24 h，游標卡尺測量抑菌圈的直徑，當抑菌圈直徑＞9 mm，認為具有抑菌活性[13]。實驗重復3次。

1.3.4 菌株的鑒定

形態學鑒定及生理生化鑒定：參考《伯杰細菌鑒定手冊》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]對篩選得到的菌株進行形態學和生理生化鑒定。生理生化實驗項目包括檸檬酸鹽實驗、硝酸鹽實驗、V-P實驗、淀粉水解實驗、接觸酶實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、H2S產生實驗、明膠液化實驗、葡萄糖產氣實驗和尿素實驗等。

分子生物學鑒定：篩選出的菌株在LB海水培養基中，28℃培養36 h。采用煮沸法提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'）對菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增[19]。PCR擴增體系：模板DNA1.0μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture 1.0 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.25 μL，引物27F（10 μmol/L）1.0 μL，引物1492r（10 μmol/L）1.0 μL，10×Loading Buffer 4.0 μL，無菌雙蒸水（ddH2O）補充至50 μL。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物于4℃保存。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至大連寶生物公司進行測序，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹，以確定該菌株的分類地位[20]。

1.3.5 抑菌譜的測定

將篩選得到的菌株按0.1%（V/V）的接種量接種到200mL LB海水液體培養基中，28℃、180 r/min條件下培養24 h，4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清，50℃條件下旋蒸至干，加入3 mL超純水，將濃縮液經0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，得到粗發酵液。

采用瓊脂擴散法測定發酵液對8種病原微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌、鮑曼不動桿菌）的抑菌活性。其中，肺炎克雷伯菌采用NB培養基；鮑曼不動桿菌采用BHI培養基；屎腸球菌采用MRS培養基；其余5種常見病原微生物采用LB培養基。

培養基融化后，室溫放置至40℃左右，接入100 μL病原微生物，輕搖混勻后倒平板，待平板凝固后用直徑9 mm的打孔器打孔，孔中加入300 μL海洋微生物的粗發酵液，37℃條件下培養24h，用游標卡尺測量每個抑菌圈的直徑。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 海洋微生物的分離純化

從北冰洋沉積物樣品中共分離純化得到314株菌，編號為1～314。

2.2 白色念珠菌拮抗菌株的篩選

采用對峙培養法從314株菌株中篩選出4株對白色念珠菌有明顯抑制作用的菌株，菌株編號為56#、83#、95#、103#。采用瓊脂擴散法測定4株菌株的抑菌圈直徑，結果見表1。由表1可知，菌株56#的抑菌圈直徑最大，為（32.14±0.72）mm，其次為菌株83#，抑菌圈直徑為（28.24±0.41）mm，菌株103#的抑菌圈最小，為（20.22±0.32）mm。其中，菌株56#發酵液的抑菌效果見圖1。由圖1可知，接種菌株56#濃縮發酵液的孔周圍出現明顯的透明圈。

表1 菌株抑菌圈測定結果Table 1 Determination results of inhibition zone of strains

圖1 菌株56#發酵液的抑菌效果Fig.1 Inhibition effect of fermentation broth of strain 56#

2.3 菌株的鑒定

菌株56#在LB海水培養基平板上的菌落形態及細胞形態見圖2。由圖2可知，菌株56#的菌落呈微隆起的圓形，黃白色，無褶皺。在電鏡下可見，菌株為明顯的桿狀，并有芽孢。

圖2 菌株56#的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.2 Colonial(a)and cell(b)morphology of strain 56#

菌株56#的生理生化鑒定結果見表2。由表2可知，菌株56#為革蘭氏陽性菌，檸檬酸鹽實驗、硝酸鹽實驗、V-P實驗、淀粉水解實驗、接觸酶實驗、明膠液化實驗、葡萄糖產氣實驗均呈陽性；吲哚實驗、甲基紅實驗、H2S實驗和尿素實驗均呈陰性。參考《伯杰細菌鑒定手冊》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]并結合形態觀察結果，初步判定菌株56屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表2 菌株56#的生理生化試驗結果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain 56#

采用MEGA 6.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖3。

圖3 菌株56#基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 56#based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株56#與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關系最近，因此，鑒定菌株56#為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 抑菌譜測定結果

菌株56#對8種病原微生物的抑菌效果見表3。由表3可知，菌株56#對大腸桿菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌都有一定的抑制作用，是一株廣譜抗菌的海洋微生物。

表3 菌株56#抑菌譜的測定結果Table 3 Determination results of antimicrobial spectrum of strain 56#

3 結論

本實驗從北冰洋沉積物樣品中分離純化出314株菌株，通過初篩得到4株對白色念珠菌有明顯拮抗作用的菌株，通過復篩，得到1株拮抗效果最好的菌株，編號為56，其抑菌圈直徑為（32.14±0.72）mm。通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定菌株56#為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其對大腸桿菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌等多種食源性致病菌都有一定的抑制作用，是一株廣譜抗菌的海洋微生物。