基于Illumina MiSeq高通量測序技術分析廣西無鹽發酵酸筍中細菌多樣性

周金沙，陳曉藝，譚金萍，陳夢娟，李笑怡，蔣立文*，黃 海

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；

2.長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410016；

3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；

4.柳州市美申園食品科技有限公司，廣西 柳州 545100）

竹筍（bamboo shoot）是禾本科多年生植物竹子的嫩莖，一般有春筍、冬筍、夏秋季節毛竹筍等，種類多，適應性強，分布廣，除部分鮮食外大部分干制食用。鮮竹筍含有豐富的營養并且味道鮮美，膳食纖維豐富，但因其采收期短、易纖維化及對貯藏條件要求高等問題[1-3]，因此我國每年有超過60%的鮮竹筍原料被用來加工制成筍干及即食調味筍等產品[4]。酸筍是以鮮竹筍為原料，配以符合飲用要求的水，不加鹽直接浸泡，自然發酵而具有特殊風味的特色食材。鮮竹筍經泡制發酵后不僅風味獨特，還可以延長其的保存期[5-6]，在我國南方地區及東南亞部分國家都有食用酸筍的習慣。

酸筍在泡制過程中形成特殊的風味和特殊滋味，除了部分來源于竹筍本身營養成分外，與微生物參與代謝有密切關系[7-8]，因此研究和分析酸筍泡制中微生物菌群結構對于揭示酸筍風味及酸筍營養物質的轉化具有重要作用。SINGHAL P等[9]以印度東北部地區傳統發酵竹筍為原料，通過生理生化試驗發現發酵大筍中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優勢，采用傳統的分離培養方法從樣品中分離得到13株菌，其中有8株均為乳桿菌屬。TAMANG B等[10]對印度東北部地區發酵竹筍制品mesu、soidon、soibum和soijim中的乳酸菌進行分離并結合隨機擴增多態性脫氧核糖核酸標記-聚合酶鏈式反應（randomamplifiedpolymorphic deoxyribonucleicacidpolymerasechainreaction，RAPD-PCR）、16S核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因測序和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）探針雜交技術等方法對乳酸菌進行基因型鑒定，發現其中的主要功能性乳酸菌有短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、Leuconostocfallax、乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）等。THAKURK等[11-12]從非鹽漬酸性發酵食品soidon的液體發酵劑“soidon mahi”中共分離得到163株菌，通過擴增核糖體DNA限制性內切酶分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）、16S rDNA測序和隨機擴增多態性DNA（RAPD）分析發現，該種酸性發酵劑的pH值為4.50±0.15，其中主要的細菌菌屬為芽孢桿菌（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。目前有關于酸筍的外文文獻中多以乳酸菌為研究重點，而國內有一些關于竹筍加鹽腌制過程中微生物多樣性的研究報道[13-16]，低鹽發酵過程中乳酸菌相對較多，高鹽發酵微生物差異很大。但目前還沒有采用泡制不加鹽發酵過程中微生物群落變化的相關研究。

本試驗以10年老酸水發酵酸筍樣品（bamboo shoot full aged fermentation，BSFAF）、泉水發酵6個月塊狀酸筍樣品（massivebambooshootfermentation，MBSF）和絲狀酸筍樣品（filamentous bamboo shoot fermentation，FBSF）為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對其細菌多樣性進行研究，初步探索酸筍細菌菌群結構，對比不同發酵時長和不同原料形狀對樣品中菌群結構的影響，為后續探索風味物質的形成與竹筍成分、微生物之間的相關性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮竹筍（毛竹筍）：廣西省柳州市桂平縣；10年老酸水及泉水：廣西省柳州市桂平縣；10年老酸水發酵酸筍樣品（BSFAF）、利用泉水發酵6個月的塊狀酸筍樣品（massive bamboo shoot fermentation，MBSF）、絲狀酸筍（filamentous bamboo shoot fermentation，FBSF）樣品：由實驗室自制。

1.1.2 化學試劑

Phusion熱啟動Flex 2X預混液（Pusion Hot Start Flex 2X Master Mix）：上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Marker：日本Takara公司；核酸定量分析試劑盒（QubitdsDNA HSAssayKit）：美國英杰生命技術有限公司；BiowestAgarose瓊脂糖G-10：法國Biowest公司；50×TAE 緩沖液：上海生工生物工程股份有限公司；AxyPre聚合酶鏈式反應（poly merase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：美國愛思進公司；RStool DNA試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

5424型常溫離心機：德國Eppendorf公司；Biocen 22 R冷凍離心機：德國WIGGENS公司；WH-861型旋渦振蕩儀：太倉華利達實驗室設備公司；DK-8D型三溫三控恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司；A200型PCR儀：杭州朗基科學儀器有限公司；MiSeq測序儀：美國Illumina公司；EPS300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀：上海天能公司；DWHL388型超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技有限責任公司；水系微孔濾膜（Φ50mm，孔徑0.22微米）：海寧郭店桃園膜分離設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸筍制作方法

將新鮮竹筍外殼去除后用清水清洗，切成塊狀或條狀，然后裝入容器中填滿，并添加泉水將其完全覆蓋后，以保鮮膜封口再蓋上蓋子進行密封發酵。10年老酸水發酵酸筍樣品則是以加工成塊狀的新鮮竹筍泡入10年老酸水中，并按上述步驟進行密封發酵。

1.3.2 酸筍樣品總DNA提取

將發酵6個月的塊狀酸筍樣品（MBSF）、絲狀酸筍（FBSF）樣品和以10年老酸水發酵酸筍樣品（BSFAF）攪拌均勻后各取50g，然后用孔徑為0.22μm的水系微孔濾膜進行抽濾。將抽濾完成后的濾膜剪碎放入微型離心管中，按照RStool DNA試劑盒說明書提取總DNA。

1.3.3 酸筍16S rDNA高通量測序方法

以酸筍總DNA為模板，進行細菌16S rDNA V3-V4區域擴增。引物為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。

PCR擴增體系：25 μL包含DNA模板25 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR預混合物。

PCR擴增條件：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環35次；最后72℃延伸10 min。

取PCR產物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯川生物技術有限公司進行高通量測序。

1.3.4 數據分析

對下機數據首先根據樣品的條形碼（barcode）信息對數據進行拆分，再根據雙端序列的重疊（overlap）關系將序列拼接（merge）成長的tags，并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除。為了保證后續結果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾去除長度小于100 bp的序列、含不確定堿基達5%以上的序列及嵌合體序列等低質量序列[17]。再以平均鄰近聚類算法通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列劃分為同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）[18-19]，挑選代表性序列使用。在核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）中進行序列比對，明確序列的分類地位。利用MAFFT（V 7.310）軟件對不同類群優勢種群的差異進行多序列比對，研究不同OTU間的系統發育關系。同時，可根據每個OTU代表序列與RDP數據庫的比對，獲得到各樣本的物種注釋結果[20-21]，經過分類統計后可得到各分類水平上物種的相對豐度信息。使用Verseach（V2.3.4）計算樣品的各項數據指標，通過Alpha和Beta多樣性分析研究單個樣本中物種的多樣性和多個樣本間菌群結構的差異[22-23]。

1.3.5 數據處理

按照生物學樣品處理基本要求，所有樣品均有3個生物學重復樣品。采用SPSS 18.0和Excel 2019進行數理統計分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 三個不同樣品測序數據統計分析

通過IlluminaMiSeq測序后9個樣品共產生了148656條有效數據（ValidTags），本次測序有效數據統計結果見表1。

表1 有效數據統計Table 1 Statistics of effective data

由表1可知，堿基質量值＞20%（Q＞20%）和30%（Q＞30%）的數據均在90%以上，平均長度為418.89 bp，表明此次測序質量較好，可進行后續數據分析。

2.2 三個不同樣品OTUs統計及分類學分析

對測序獲得的148656條有效數據進行聚類分析，OTUs聚類后3組樣品中總共得到1116個OTUs，根據3組樣品中的OTUs聚類繪制的Venn圖見圖1。

圖1 三個樣品中OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution in three samples

由圖1可知，FBSF、BSFAF和MBSF樣品中OTUs的數目分別為537、461及391，而3組樣品中共有的OTUs僅有25種。FBSF和BSFAF共有57種，FBSF和MBSF共有191種，BSFAF和MBSF共有50種。對FBSF和MBSF樣品中OTUs數目進行比較后發現，在相同試驗條件下泡制的不同形狀的竹筍中細菌菌群數量存在差異，說明原料處理方式如全筍發酵、塊狀發酵及絲狀發酵可能對發酵過程中微生物種類產生影響。另一方面，對比塊狀酸筍和10年老酸水泡制的酸筍的OTU，可以發現酸水的來源也可能影響微生物數量。

2.3 三個不同樣品Alpha多樣性分析

Chao1指數曲線是反映樣品微生物豐富度的指標，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OUT。基于高通量測序技術對酸筍細菌的Chao1指數進行分析，Chao1指數曲線見圖2。

圖2 酸筍樣品稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of sour bamboo shoot samples

由圖2可知，隨著測定序列數目的增加，樣本的Chao1指數值均＞300，說明3種樣品的物種多樣性和豐富度都較高。從樣品重復性稀釋曲線情況來說，曲線均趨于相對平緩，測序達到10000以上基本趨于平緩，可以說明樣品中基本代表樣品OTU實際情況，能夠反應樣品中微生物多樣性豐富程度，可以評價覆蓋所有微生物類群。

3組樣品中細菌群落多樣性指數的統計結果見表2。由表2可知，coverage指數均＞0.99，因此證明本次實驗的取樣合理。FBSF的Shannon和Simpson指數均顯著高于其他酸筍樣品（P＜0.05），分別為3.60和0.85；而MBSF分別為2.89和0.77，低于FBSF；BSFAF這兩個指數均最低，分別為2.26和0.45，且3組樣品間差異顯著（P＜0.05）。

FBSF的ACE指數和檢測物種總數最高，顯著高于其他兩組（P＜0.05），而BSFAF和MBSF兩組的ACE指數與檢測物種總數無顯著性差異（P＞0.05），表明BSFAF和MBSF兩組中微生物物種豐富度幾乎相同且與FBSF組顯著不同。這些結果表明，原料切分的狀態不同，與酸水接觸面積差異大，可能導致發酵酸筍中微生物的豐富度與均勻性差異較大。

表2 酸筍樣品中細菌群落多樣性指數統計Table 2 Diversity index of fungal community in sour bamboo shoot samples

此外BSFAF和MBSF兩組比較發現，雖然不同來源酸水泡制的樣品中物種數量差異不顯著（P＞0.05），但MBSF中微生物菌群的豐富度和均勻性顯著高于10年老酸水泡制的酸筍（P＜0.05）。由此說明以泉水泡制發酵酸筍可能更好。

綜上，FBSF的Alpha多樣性優于其他組，由此說明絲狀發酵的酸筍在微生物多樣性上有明顯優勢。

2.4 三種不同樣品Beta多樣性分析

對測序獲得的有效數據進行Beta多樣性分析，采用R語言vegan包進行相似性分析，基于weighted unifrac和unweighed unifrac兩種距離算法，來檢驗組間的差異顯著性，結果見表3。

表3 相似性分析結果Table 3 Results of analysis of similarities

由表3可知，在weighted unifrac和unweighed unifrac兩種距離算法下，相關系數R分別為1.00和0.99，且P值均＜0.01，表明樣本間的Beta多樣性差異很大。

3個樣品主坐標分析（principalcoordinateanalysis，PCoA）結果見圖3。由圖3可知，在weighted unifrac算法下，其坐標軸1、2主要貢獻度之和為99.52%，表明已經可以較好地反映各樣本在圖上的種群結構差異，計算3組樣本在圖3中點的分布距離可以看出，FBSF和MBSF兩組距離較近，但與BSFAF組的距離遠，表明FBSF和MBSF樣品中的細菌菌群結構比較接近，與BSFAF組中細菌菌群結構差異較大，可能與兩個6個月發酵樣品發酵條件類似有關，但10年老酸水發酵酸筍酸水中積累了較多菌群，因此菌群結構才會出現較大的差異。

圖3 主坐標分析結果Fig.3 Results of principal coordinate analysis

2.5 三種不同樣品中物種注釋及分類

將前面分析獲得的OTU代表序列與核糖體數據庫進行比對，門分類水平上樣品菌群差異結果見圖4，屬分類水平上樣品菌群差異結果見圖5和圖6。

由圖4可知，在門分類水平上，3組樣品中共注釋到12個門類，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、未知細菌類（Bacteria unclassified）、藍藻門（Cyanobacteria）、Candidatus Saccharibacteria、梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）及綠彎菌門（Chloroflexi）。FBSF、MBSF和BSFAF 3組樣品中厚壁菌門（Firmicutes）是占絕對優勢的門類，平均相對豐度分別為99.94%、87.02%和92.64%，其次是變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。3組樣品中BSFAF組中注釋到細菌門類最多有11個，而FBSF組和MBSF組樣品中注釋的門類較少，各有3個，這可能是因為10年老酸水在長期重復發酵中有微生物沉積，所以細菌門類最多。

圖4 門分類水平上樣品相對豐度Fig.4 Relative abundance of sample at the phylum classification level

圖5 屬分類水平上樣品相對豐度Fig.5 Relative abundance of sample at the genus classification level

屬分類水平上的物種注釋圖和熱圖分別見圖5和圖6。由圖5和圖6可知，在FBSF、MBSF和BSFAF3組樣品中的優勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）。其次，從FBSF和MBSF兩組中可看出，雖然試驗條件相同，但塊狀和絲狀酸筍樣品中的細菌菌群結構存在較明顯的差異，FBSF組中的乳桿菌屬（Lactobacillus）顯著高于塊狀酸筍（MBSF）組，其平均相對豐度分別為85.39%和66.66%。但3組樣品中，僅MBSF組中乳球菌屬（Lactococcus）的平均相對豐度最高（平均相對豐度為23.39%）。造成這樣差異的原因可能是與原料的加工程度有關，當原料被切絲后使竹筍中的內生菌外流并且參與到發酵過程中。最后，對比BSFAF組與發酵6個月的兩種酸筍樣品組的細菌菌群結構可發現，發酵時間更長的無鹽泡制酸筍中細菌種類較其他兩組更多，這可能是發酵時間長，老酸水可以作為下一批次發酵“引子”的物質基礎。這也說明10年老酸筍水中的微生物菌群一直處于動態變化中，從而在菌群結構及豐度上與發酵時間短的的酸筍混合樣品存在較大差異。

圖6 屬分類水平上熱圖分析Fig.6 Heatmap analysis at genus level

此外對3組樣品中常見益生菌菌屬：乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）的平均相對豐度的總和進行統計后發現，FBSF組中平均相對豐度的總和最高，可達99.8%，這3個屬的相對豐度含量分別為85.39%、5.52%和8.88%；其次是MBSF組，平均相對豐度的總和為91.17%，3種菌相對豐度分別為66.66%、23.39%和1.07%；而BSFAF組中最低，總和依然能達到81.94%，3種菌相對豐度分別為80.90%、0.52%和0.52%。這些結果與洪秀榮[13]采用干筍糟制過程乳酸菌包括發酵乳桿菌、片球菌、鏈球菌、腸膜明串珠菌有部分相似。夏秀娟等[14]研究發現，中等鹽濃度研制麻竹筍，腌制過程中乳酸乳球菌含量逐漸升高，腌制14 d達到最大值時增加了6個數量級。夏秀娟等[15]研究高鹽腌制麻竹筍的細菌群落組成及低鹽腌制筍中微生物發酵，發現低濃度鹽發酵主要包括綠色氣球菌、乳球菌屬、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、芽孢桿菌屬，高鹽鹽漬以綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）等[16]為主。本研究采用的新鮮麻竹筍不加鹽直接泡制發酵，與高、中、低鹽研制酸筍發酵結果相比，乳酸菌相對含量極高，并且Enterobacteriaceaeunclassified、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）及腸球菌屬（Enterococcus）等具有潛在危害的菌屬的含量極低，因此，無鹽發酵酸筍可能更有利于發酵及生產。3結論

本試驗采用高通量測序技術對10年老酸水泡制的酸筍樣品（BSFAF）及用泉水泡制發酵6個月塊狀（MBSF）和絲狀酸筍樣品（FBSF）中細菌多樣性進行研究。在3組樣品中共注釋到12個門、23個綱、37個目、98個科、190個屬。通過在屬水平上的物種注釋結果可以看出，樣品FBSF和MBSF中菌屬的結構及相對豐度不同，其中FBSF組中益生菌屬的相對豐度高于MBSF組。同時，根據Alpha多樣性分析結果可知，絲狀酸筍（FBSA）的Shannon、Simpson及ACE指數均顯著高于塊狀發酵酸筍（MBSF）（P＜0.05），所以絲狀酸筍可能更有利于無鹽發酵酸筍的生產。將塊狀酸筍組（MBSF）與10年老酸水組（BSFAF）對比發現，MBSF中微生物菌群的豐富度和均勻性顯著高于10年老酸水泡制的酸筍，由此說明以泉水泡制發酵酸筍可能更好。

此外，本試驗發現無鹽發酵酸筍體系中存在大量乳酸菌類存在，是一個乳酸菌資源庫。之后的研究應對發酵全過程為研究重點，全面剖析發酵過程中微生物群落變化、營養變化、風味變化規律，找到關鍵微生物及其基因，為竹筍生物技術加工提供強力技術支撐，為具有地域性特色的食材工業化、規模化、可控化提供理論基礎。