Viili直投式發酵劑復配及發酵性能研究

杜佳峰，李 琪，高 潔，任 帥，桑亞新*

（河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000）

Viili發酵乳是芬蘭傳統的乳制品，通常采用常溫（28℃左右）發酵，具有良好的口感和令人愉快的風味，含有大量的多糖成分[1]。Viili發酵乳是由在乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌白地霉（Geotrichum candidum）等多種微生物共同發酵而成，因此Viili發酵乳不僅具有傳統發酵乳的雙乙酰風味和乙醛風味，同時還具有特殊的白地霉香味[2]。相較于保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）發酵的發酵乳，具有獨特的風味和品質。

Viili發酵乳不僅具有優良的風味品質，還具有抗疲勞[3]、調節免疫[4]、降低膽固醇[5]、抗氧化[6]等多種功能活性。近些年對Viili發酵乳的研究主要集中于對其胞外多糖以及菌種組成方面的研究[7-10]，缺乏對Viili發酵性能及理化性質等方面的深入了解及產品的研發。由于Viili發酵乳菌相較為復雜，產酒精產氣微生物的存在使Viili發酵乳酒精控制以及品質控制等問題越發突出，制約了其發酵產品的多元化發展。直投式酸奶發酵劑（direct-vat-set，DVS）具有菌相明確、高菌量、高菌活的菌種特點，并且能夠方便快捷、安全有效的生產乳制品[11]，已經成為商業乳制品發酵生產的主要方式。開發Viili直投式發酵劑能夠解決Viili發酵過程菌相不明確的問題，可以通過控制發酵菌種得到優良穩定的Viili發酵產品，具有廣泛的應用前景。

目前，我國發酵乳產品同質化現象較為嚴重，發酵菌種較為單一，因此，Viili直投式發酵劑及Viili發酵乳的研究與開發對發酵乳品的多元化具有十分重要的意義。針對上述問題，本研究以最優發酵條件下的Viili發酵乳為比較標準，通過對不同菌相的優化復配，開發發酵性能優良，并能夠產生Viili特色風味和品質的直投式發酵劑，為后續Viili產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）LB-DR、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）St-G、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）BY3、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）NEER：本實驗室保藏；假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）Lp-S、白地霉（Galactomyces candidum）Gc-S：篩選自Viili發酵乳。

1.1.2 化學試劑

Viili發酵乳：芬蘭乳品Valio集團；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：天津市福晨化學試劑有限公司；鄰苯二胺、雙乙酰標準品：國藥集團化學試劑有限公司；可溶性淀粉、亞硫酸氫鈉、碳酸氫鈉：天津市天利化學試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

脫脂乳培養基：將脫脂奶粉溶于水，配制成質量分數為12%的復原乳，100℃滅菌15 min；MRS培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

721可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；7al-16a高速冷凍離心機：德國海蒂詩有限公司；FE20KpH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SKP-02.300恒溫培養箱：黃石市恒豐醫療器械有限公司；NDJ-5S數字式黏度計：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Viili發酵乳制備及前處理

將Viili發酵乳以3%接種量接入滅菌脫脂乳培養基中28℃進行培養[5-6]，每隔2 h進行取樣分成兩組。一組不進行處理，直接進行pH值、酸度、持水力（water holding capacity，WHC）以及表觀黏度的測定；另一組取適量不同發酵時間的Viili發酵乳，加入等體積的16%三氯乙酸（TCA）溶液，充分混勻后靜置10 min，在4℃的離心機中以4 500 r/min離心10min，將上清液再用濾紙進行過濾，取澄清上清液用于雙乙酰含量及乙醛含量測定[12]。

1.3.2 菌株復配分組及樣品處理

根據對Viili菌種組成的相關文獻[13-15]及實驗室前期利用Illumina測序和聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術對Viili發酵乳研究結果選取5株乳酸菌、1株酵母菌、1株霉菌作為復配菌種，乳酸菌和酵母菌分別經過兩次活化后進行不同組合復配發酵，以3%接種到滅菌脫脂乳培養基中28℃進行培養發酵，每間隔1 h進行pH值測定，同時對7組的凝乳時間進行觀察。發酵乳處理方法如1.3.1，分組方式如下：

V1組：St-G+LB-DR（162∶16）；V2組：St-G+LB-DR+BY3（162∶16∶8）；V3組：St-G+LB-DR+Lp-S（162∶16∶14）；V4組：St-G+LB-DR+BY3+Lp-S（162∶16∶8∶14）；V5組：St-G+LB-DR+BY3+Lp-S+Gc-S（162∶16∶8∶14∶74）；V6組：St-G+LB-DR+BY3+Lp-S+NEER（162∶16∶8∶14∶1）；V7組：St-G+LB-DR+BY3+Lp-S+Gc-S+NEER（162∶16∶8∶14∶74∶1）。

1.3.3 分析檢測

（1）pH值的測定

使用pH計直接測定不同發酵時間Viili發酵乳的pH值。（2）酸度的測定

參照國標GB5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》中的方法進行測定。

（3）持水力的測定[16]

在10 mL離心管中加入5 mL不同發酵時間的發酵乳樣品，以3 000 r/min離心10 min后，靜置10 min后棄去上清液，測定剩余的質量，樣品的持水力計算公式如下：式中：WHC為樣品持水力，%；W0為空10 mL離心管質量，g；W1為樣品與離心管的總質量，g；W2為剩余樣品與離心管總質量，g。

（4）表觀黏度的測定[17]

用黏度計三號轉子以30 r/min常溫條件下測定其表觀黏度。

（5）雙乙酰含量的測定[12]

乙酰酰標準曲線繪制：取20 μL雙乙酰（2,3-丁二酮）標準品，蒸餾水定容至500 mL，分別取0、2.0 mL、4.0 mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL于空試管中用水補足到10mL。每個試管中再加入10 mL的16%三氯乙酸。取12支編號的試管分別加入上述不同濃度的樣品10 mL分兩排擺放，每排6支試管。第一排試管中加入0.5 mL的1%的鄰苯二胺溶液，第二排試管不加作為空白對照，將試管搖勻后置于黑暗處。反應30 min后加入4.0 mol/L鹽酸終止反應，第一排試管加2.0 mL鹽酸，第二排試管加2.5 mL鹽酸，振蕩混勻后以第二排試管空白作為參比液，在波長335 nm條件下測定吸光度值。以雙乙酰質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制雙乙酰標準曲線。

樣品中雙乙酰濃度的測定：取1.3.1節中處理好的各個樣品澄清液，用16%的三氯乙酸溶液稀釋適當的倍數，按照雙乙酰標準曲線的方法測定樣品吸光度值，使其范圍在0.2～1.0之間，再根據雙乙酰標準曲線回歸方程計算Viili樣品中雙乙酰質量濃度（mg/L），如果樣品稀釋則再需要乘以稀釋倍數得到樣品中雙乙酰含量。

（6）乙醛含量的測定[12]

取1.3.1節中處理好的各個樣品的上清液10 mL，加入1%的NaHSO3溶液2.0 mL于250 mL具塞三角瓶中，搖勻后在室溫狀態下靜置1 h，加入1 mL1%淀粉溶液，先用濃度為0.10 mol/L的碘標準溶液滴定至臨近終點，再用濃度為0.01mol/L碘標準溶液滴定至終點（溶液呈淡藍紫色，且30s內不褪色），不計數。再加入20 mL的1 mol/L的NaHCO3溶液，混勻至溶液藍紫色消失，用0.01 mol/L碘標準溶液滴定至終點，此時記錄消耗的標準碘液的體積，同時做空白試驗。乙醛含量計算公式如下：式中：V1為樣品滴定消耗I2標準溶液的體積，mL；V2為空白滴定消耗I2標準溶液的體積，mL；C為1/2 I2標準溶液的濃度，mol/L；0.022為乙醛化學反應基本單位，g；10為乙醛樣品體積，mL。

2 結果與分析

2.1 雙乙酰標準曲線的建立

以雙乙酰質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制雙乙酰標準曲線，結果見圖1。

圖1 雙乙酰標準曲線Fig.1 Standard curve of diacetyl

由圖1可知，雙乙酰質量濃度范圍為0～20 mg/L，標準曲線線性回歸方程為y=0.046 6x+0.075 7，相關系數為R2=0.990 4＞0.99，表明雙乙酰標準液質量濃度與吸光度值之間呈良好的線性關系，可以用于雙乙酰含量測定。

2.2 Viili發酵乳不同發酵時間理化性質

不同發酵時間的Viili發酵乳基本理化指標見圖2。由圖2A可知，在Viili發酵乳發酵前12 h的pH值從6.34迅速下降到4.69，而12～24 h內的pH值變化較小基本維持在4.4左右。而酸度的變化在前12 h酸度由13.2°T顯著上升至91.85°T，12h后變化較小，維持在100.65°T左右。由圖2B可知，發酵前12 h的Viili發酵乳持水力呈現逐漸增加的趨勢，而后12～24 h持水力有小幅度增加，最終到24 h增加至66.5%。由圖2C可知，由于胞外多糖的累積導致Viili發酵乳的表觀黏度持續增加，在24 h達到最高值為10 440 mPa·s。由圖2D和2E可知，發酵乳中雙乙酰含量以及乙醛含量在0～12 h均呈現遞增趨勢且在12 h含量達到頂峰，即雙乙酰含量達到15.672mg/L，乙醛含量達到10.63mg/L。而后12～24 h雙乙酰含量以及乙醛含量均呈現下降的趨勢。

圖2 不同發酵時間的Viili發酵乳基本理化指標Fig.2 Basic physical and chemical indexes of Viili fermented milkwith different fermentation time

綜上所述，Viili發酵乳最適發酵時間為12 h，此時pH值為4.69，酸度為91.85°T，持水力為51.78%，表觀黏度為4457mPa·s，雙乙酰含量為15.67mg/L，乙醛含量為10.63mg/L。

2.3 菌株復配發酵酸奶pH值及凝乳時間的測定

將活化后的5株菌及白地霉孢子懸濁液按比例分組接入12%脫脂奶中，28℃條件下恒溫發酵，不同分組的菌株復配發酵酸奶的pH變化曲線見圖3，同時觀察凝乳時間，結果見表1。

圖3 不同組別酸奶發酵過程中的pH值變化Fig.3 Change of pH of yoghurt during fermentation process with different groups

表1 不同組別酸奶發酵過程中的凝乳時間Table 1 Curding time of yoghurt during fermentation process with different groups

由圖3可知，隨著發酵時間延長，7組發酵酸奶pH均呈下降趨勢，7組都是在0～3 h內pH值變化不明顯，因為此時菌株基本處于延滯期，菌株生長緩慢，在3 h后產酸加快7組產酸量逐漸拉開差距。由表1可知，添加真菌組（V5、V6、V7）產酸速度明顯高于純乳酸菌發酵組（V1、V2、V3、V4），且添加真菌組較純乳酸菌發酵組凝乳時間明顯縮短。純乳酸菌發酵組中V4組產酸速度明顯高于其余三組。由此可以得出，V5組和V7組發酵乳產酸能力較好，具有較短的凝乳時間（19 h）。

2.4 菌株復配發酵酸奶的理化性質

7組不同菌株復配酸奶發酵完成后，對7組酸奶進行基礎理化指標測定，結果見圖4。

圖4 不同組別發酵酸奶的基本理化指標Fig.4 Basic physical and chemical indexes of fermented yoghurt in different groups

由圖4可知，V7組呈現出較優異的理化性質。只添加乳酸菌的四組中，V4組的各項理化指標較優于其他三組，證明本試驗所用四組乳酸菌：嗜熱鏈球菌St-G、保加利亞乳桿菌LB-DR、乳酸乳球菌乳脂亞種BY3、假腸膜明串珠菌Lp-S可在牛乳中協同發酵，且V1、V2、V3、V4的各個理化指標含量除乙醛含量外，均是呈現V4＞V2＞V3＞V1。添加真菌的三組V5、V6、V7各項指標均高于純乳酸菌發酵的組別，白地霉Gc-S和克魯維畢赤酵母NEER共同存在的V7組的酸度為74.73°T，持水力為38.10%，表觀黏度為7780mPa·s，雙乙酰含量為7.87 mg/L，乙醛含量為15.4 mg/L。

2.5 Viili發酵乳與菌株復配酸奶理化性質比較

將與Viili發酵乳類似菌株進行復配，且選擇復配菌株酸奶理化性質最優異的V7組與Viili發酵乳理化性質進行對比，結果見表2。

由表2可知，復配菌株發酵V7組與Viili發酵乳12 h的理化性質相對比，復配菌株組與Viili發酵乳的表觀黏度有顯著差異（P＜0.05），復配菌株組呈現更好的表觀黏度；復配菌株發酵酸奶V7組在酸度、持水力、雙乙酰含量均略低于Viili發酵乳，但二者差異不顯著（P＞0.05）；復配菌株發酵酸奶最適發酵時間為19 h，與Viili發酵乳發酵時間（12 h）相比時間較長。結果表明，本試驗所選的復配菌株以及菌株間比例較為合適，可用于后續Viili發酵乳直投式發酵劑的開發。

3 討論

pH值、酸度、持水力和表觀黏度是衡量發酵乳產品重要的理化指標。發酵乳凝乳的主要原因是發酵乳中的乳酸菌發酵牛乳中乳糖產生乳酸，乳酸的增加使發酵乳的整體pH值下降，當pH值降至4.6～4.7時達到酪蛋白的等電點[18]，使奶中形成的酪蛋白膠粒開始聚集沉降，蛋白質網絡立體結構隨著酪蛋白膠粒的聚集逐漸形成[19]，使流動的奶變成半固體的凝膠體—凝乳[20-21]。這個過程會伴隨持水力以及表觀黏度值的變化。

發酵乳的酸度主要是乳酸菌通過發酵脫脂奶中的乳糖產生乳酸引起的，pH值和酸度的高低不僅關系到發酵乳的風味[22]，還影響發酵乳的凝膠特性。凝固型發酵乳持有全部或者部分自身水的能力被定義為發酵乳的持水力。持水力和表觀黏度反映出酸奶的質構及流變特性。持水力和表觀黏度的增加體現了發酵乳中凝膠交聯增加、無乳清析出，即發酵乳肉眼可見的黏稠、易貼壁，且口感濃醇[23]。Viili發酵乳中含有豐富的微生物種類，微生物的生長代謝過程會在Viili發酵乳中形成一層較厚的黏液樣的胞外多糖[24]，有文獻報道胞外多糖能夠增強酸的的持水能力，可以有效防止乳清的析出，能夠較長時間的維持發酵乳的品質[25]。因此在Viili發酵乳發酵12～24 h表觀粘度持續增加，持水力有小幅增加。

除品質以外，風味氣味也是衡量酸奶品質的重要標準。雙乙酰和乙醛是發酵乳中主要的香氣成分。雙乙酰一般由嗜溫乳酸球菌生產，包括乳酸乳球菌丁二酮亞種（Lactococcus lactissubsp.biovar diacety lactis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）、鏈球菌和熱鏈球菌等[26]。有文獻證明[27]發酵乳制品發酵時間過長會導致雙乙酰和乙醛含量降低，根據雙乙酰的發酵代謝途徑，雙乙酰在發酵后期能在3-羥基丁酮脫氫酶的作用下可逆地生成3-羥基丁酮，并進一步轉化為2,3-丁二醇，導致雙乙酰含量下降。而乙醛則是因為發酵過程乙醛還原酶的存在使發酵乳中乙醛的含量出現降低的現象[28]。Viili的風味品質與其菌種組成有密切關系，其中乳酸菌、酵母菌和白地霉共同形成了Viili的獨特風味。國外工廠為方便Viili發酵乳的市場銷售，將其中傳統酵母菌替換成無醇酵母，雖降低了Viili特有酒香[3]，但保留了Viili發酵乳多菌發酵的奶香。因此，在本研究的直投式發酵劑中，進行了三類菌相的不同復配組合，選取發酵乳主要香氣成分乙醛和雙乙酰作為香氣衡量指標。

嗜熱鏈球菌St-G、保加利亞乳桿菌LB-DR、假腸膜明串珠菌Lp-S、乳酸乳球菌乳脂亞屬BY3這四株菌可以在牛乳中協同發酵加速產酸，從而達到縮短發酵時間的效果。乳酸乳球菌乳脂亞屬BY3可將牛奶中的乳糖發酵形成乳酸，降低牛乳中pH值，進而產生風味物質雙乙酰和乙醛，因此V2、V3、V4組各項指標均高于V1組。復配發酵酸奶在乙醛含量中V3＞V2，主要原因推測在本試驗中所用的乳酸乳球菌乳脂亞屬BY3和假腸膜明串珠菌Lp-S均具有良好的產乙醛特性，但是由于最初接種量假腸膜明串珠菌Lp-S相對較多，因此在復配發酵酸奶中V3組含量較V2組多。由V6組可以看出，雖然克魯維畢赤酵母NEER添加量較少，但是對酸奶pH值起到積極影響。主要原因是克魯維畢赤酵母NEER屬于非釀酒酵母，在發酵過程中可以產生甘油、揮發酸、琥珀酸和乳酸等代謝產物，可以增加酸奶中酸度，降低pH值促使蛋白質達到等電點產生凝膠現象，以此縮短凝乳時間，同時促進香味產生[29]。白地霉可以產生脂肪酶和蛋白酶，白地霉通過其在蛋白質代謝和脂肪代謝途徑增加了奶制品的香氣和口感滋味。部分白地霉可以產生氨肽酶，這種酶可以降解奶制品中低分子質量肽，在奶制品的風味中起到降低肽產生的苦味增加獨特香味的作用。V5、V7組pH值變化曲線基本重疊且凝乳時間相同，說明在混菌發酵中白地霉Gc-S會增加產酸能力，并且白地霉Gc-S對產酸的影響遠遠大于克魯維畢赤酵母NEER的影響。同時有文獻報道酵母菌和白地霉混合培養對奶酪香氣化合物形成具有一定的積極影響[30]。

本研究得到V7組具有優良穩定的發酵性能，綜合理化性質良好，且品質更接近于Viili發酵乳。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）St-G、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）LB-DR、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）BY3、假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）Lp-S、白地霉（Galactomyces candidum）Gc-S和克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）NEER明確的菌種組合解決了Viili發酵過程中菌相復雜，難以控制的問題，并保留了Viili發酵乳的黏稠、表面具有絲狀絨毛的特征屬性及獨特的風味。

4 結論

本研究結果表明V7組為最優菌相復配組合發酵劑，為嗜熱鏈球菌St-G、保加利亞乳桿菌LB-DR、乳酸乳球菌乳脂亞種BY3、假腸膜明串珠菌Lp-S、白地霉Gc-S和克魯維畢赤酵母NEER以162∶16∶8∶14∶74∶1比例進行復合，其在28 ℃發酵條件下發酵19 h后所產發酵乳與Viili發酵乳理化性質最為接近，可作為Viili直投式發酵劑用于多元化Viili發酵乳產品的研發。