成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪中生物活性肽的影響

宋雪梅，梁 琪*，張 炎，吳 晗

（1.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；

2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

乳蛋白在加工或者胃腸消化過程中由于酶的作用能夠產生生物活性肽，被認為是許多生物活性肽的重要來源。生物活性肽含有2～20個氨基酸殘基，以不同排列和組成方式構成，具有免疫調節、降血壓、抑菌、抗氧化、抗癌等作用[1-4]，可對多種代謝和生理功能進行積極調節，從而影響機體健康[5]。近年來，隨著消費者對生活質量提高的持續關注以及功能性食品的開發，生物活性肽成為醫藥、食品等領域的研究熱點。

干酪富含乳蛋白，在加工過程特別是在成熟過程中，因自身存在的降解蛋白質的纖溶酶、凝乳酶和微生物活動所釋放的蛋白酶、肽酶等的作用，產生了具有抗氧化、抑菌和降血壓等功能的多肽。已在Blue、Danablue、Munster、Camembert和Brie等干酪中發現了水溶性肽和體積分數為70%乙醇可溶性肽均具有顯著抗氧化作用[6]。在Pecorino Romano干酪水溶性提取物中發現了抑菌肽[7]。在Cheddar干酪中鑒定出了6條具有血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）抑制作用的多肽[8]。干酪生物活性肽的形成與蛋白質降解密切相關，而凝塊pH值、鹽含量、成熟條件、發酵劑等均影響蛋白質降解[9]，因此不同干酪的多肽組成和生物活性具有差異[10]。

牦牛乳硬質干酪以生活在青藏高原海拔3 000 m以上的牦牛乳為原料，經凝乳、發酵、排乳清等工序后制作而成，成熟期長，營養價值高。前期研究發現，提高成熟溫度能夠促進牦牛乳硬質干酪的蛋白質降解，加快干酪成熟[11]，本文擬研究成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪中生物活性肽的影響，以探究牦牛乳硬質干酪生物活性肽的形成規律，為深入挖掘牦牛乳硬質干酪的功能特性提供科學依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳：采自甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉；CHOOZIT型乳酸菌發酵劑[保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）]：丹麥丹尼斯克公司；精制小牛凝乳酶（酶活力10萬U/g）：蘭州生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaures）、大腸桿菌（Escherichia coli）：本實驗室保藏；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；牛肉膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養基制品廠；蛋白胨（生化試劑）：上海中秦化學試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：上海山浦化工有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

干酪槽：本實驗室自制；TGL-20高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-5100真空包裝機：廣東中山市名康包裝機械廠；723紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Scientz-10ND真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HZQ-X300電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干酪制作

參考劉興龍等[12]的方法制作干酪。新鮮干酪在5℃、10℃、15℃分別成熟4、5、6個月后，將不同成熟階段的干酪儲藏在-18℃備用。

1.3.2 干酪水溶性多肽的提取

參考RIZZELLOCG等[7]的方法提取。以料液比1∶3（g∶mL）加入50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0），150 r/min、40℃恒溫振蕩1h后，4℃、4 200 r/min離心30 min，除去上層脂肪后，濾紙真空過濾，將濾液pH值調至4.6，4℃、7 500 r/min離心10 min后，即獲得上清液，上清液通過0.22μm濾膜過濾，真空冷凍干燥，-18℃儲藏備用。

1.3.3 干酪水溶性多肽抗氧化活性測定

參考SUN T等[13]的方法略作改進。將2 mL樣液和2 mL 0.125 mmol/L DPPH溶液，充分振搖后，置于暗處室溫反應30 min，再在波長517 nm處測得吸光度值A，以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，測得吸光度值Ab，以等體積蒸餾水代替樣品溶液，測得吸光度值A0，按下列公式計算樣品對DPPH自由基的清除率：

1.3.4 干酪水溶性多肽抑菌活性測定

參照曾維才等[14]的方法略作修改。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為抑菌對象，采用打孔法進行抑菌活性測定。將一定濃度的菌懸液按照1∶10（V/V）倒入培養基混合均勻后倒平板，并打孔形成直徑8 mm孔洞，將一定濃度干酪水溶性多肽0.1mL注入孔內，生理鹽水作空白對照，37℃培養24 h后，觀察抑菌效果，每組重復3次，取平均值。

1.3.5 干酪水溶性多肽ACE抑制活性測定

參考楊銘等[15]的方法測定。樣品組（A）加入200μLHHL和100μLACE抑制劑；對照組（B）加入200μLHHL；空白組（C）加入250 μL、1 mol/L HCl和200 μL HHL，37 ℃水浴中加熱3 min，同一溫度條件下均加入20 μLACE反應30 min；再在A組加入250 μL HCl終止反應；B組加入250 μL HCl和100℃硼酸鈉緩沖液；C組加入100 μL硼酸鈉緩沖液。每組試劑在5 mL離心管中混勻，反應結束后加入1.7 mL乙酸乙酯，振蕩、混勻后，4℃、4000r/min離心15min，吸取1.0mL乙酸乙酯于試管中，120℃烘干30min，加入3mL去離子水，在波長228 nm處測定吸光度值A。按下列公式計算樣品對ACE的抑制率：

式中：A

A

為樣品組吸光度值；A

B

為對照組吸光度值；A

C

為空白組吸光度值。

1.3.6 數據統計與分析

采用SPSS19.0對試驗數據進行處理，如果方差分析差異顯著，用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 成熟條件對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抗氧化性的影響

DPPH自由基是一種穩定的有機自由基，能接受抗氧化劑提供的電子或質子形成穩定化合物[16]，因此，本試驗以清除DPPH自由基的能力來衡量干酪水溶性多肽的抗氧化活性。不同溫度及成熟時間對牦牛乳硬質干酪DPPH自由基清除率的影響結果見表1。

由表1可知，成熟溫度≤10℃之前、成熟時間在4～5個月時，干酪水溶性多肽對DPPH自由基清除率呈現增加趨勢，成熟時間在5～6個月時，其水溶性多肽對DPPH自由基清除率呈現降低趨勢，且成熟5、6個月干酪的水溶性多肽的抗氧化性之間存在顯著性差異（P＜0.05）。成熟溫度為15℃時，干酪水溶性多肽抗氧化作用呈現降低趨勢，且成熟5、6個月干酪的水溶性多肽抗氧化作用沒有顯著性差異（P＞0.05）。GUPTA A等[17]對不同成熟階段Cheddar干酪抗氧化性研究發現，成熟4個月之前，干酪抗氧化作用增強，4個月后，干酪抗氧化性降低，在7～9個月期間，保持不變。4℃儲藏20d和25℃儲藏5 d的Himalayan干酪的水溶性多肽的抗氧化性增強，而-18℃儲藏20 d的干酪抗氧化性不受影響[18]。方差分析顯示，成熟溫度、時間及兩者交互作用對干酪水溶性多肽抗氧化作用影響極顯著（P＜0.01）。

表1 成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽DPPH自由基清除率的影響Table 1 Effect of ripening temperature and time on DPPH radical scavenging rate of water-soluble peptides in hard cheese made by yak milk

2.2 成熟條件對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的影響

不同成熟溫度及時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的作用結果見圖1。從圖1可知，在4～6個月成熟過程中，5℃、10℃、15℃成熟干酪的水溶性多肽對大腸桿菌的抑制程度分別呈現增強趨勢，且5℃、10℃、15℃成熟6個月干酪的水溶性多肽分別比相同溫度成熟4個月干酪對大腸桿菌的抑制作用顯著提高15.43%、12.44%和8.32%（P＜0.05）。

圖1 成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的影響Fig.1 Effect of ripening temperature and time on antimicrobial activity of soluble peptides of hard cheese made by yak milk against Escherichia coli

成熟溫度從5℃提高至15℃時，干酪水溶性多肽對大腸桿菌的抑菌作用也呈顯著增加趨勢（P＜0.05）。15℃成熟4個月干酪的水溶性多肽比5℃相同成熟時間干酪的水溶性多肽對大腸桿菌的抑制程度顯著提高13.48%（P＜0.05），15℃成熟6個月干酪的水溶性多肽對大腸桿菌的抑制程度比5℃相同成熟時間干酪的水溶性多肽顯著提高6.49%（P＜0.05）。方差分析顯示，成熟溫度、時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的效果影響顯著（P＜0.05）。FIALHO T L等[19]發現源自卡納斯特拉的手工干酪的水溶多肽也能抑制大腸桿菌。

2.3 成熟條件對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制金黃色葡萄球菌的影響

從圖2可知，5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬質干酪的水溶性多肽均對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，在4～6個月成熟過程中，對金黃色葡萄球菌的抑制程度分別呈現增強趨勢。5℃成熟5個月與成熟4個月、6個月干酪的水溶性多肽對金黃色葡萄球菌的抑制作用之間沒有顯著差異（P＞0.05），5℃成熟6個月比相同溫度成熟4個月干酪的水溶性多肽對金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高13.55%（P＜0.05）。10℃、15℃成熟6個月比相同溫度成熟4個月干酪的水溶性多肽對金黃色葡萄球菌的抑制作用分別顯著提高16.36%和12.02%（P＜0.05）。

圖2 成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制金黃色葡萄球菌的影響Fig.2 Effect of ripening temperature and time on antimicrobial activity of soluble peptides of hard cheese made by yak milk againstStaphylococcus aureus

成熟溫度從5℃提高至15℃時，干酪水溶性多肽對金黃色葡萄球菌的抑菌作用也呈增加趨勢。15℃成熟4個月比5℃成熟相同時間干酪的水溶性多肽對金黃色葡萄球菌的抑制程度顯著提高8.25%（P＜0.05），15℃成熟6個月干酪比5℃成熟相同時間的干酪的水溶性多肽對金黃色葡萄球菌的抑制程度顯著提高6.80%（P＜0.05）。方差分析顯示，成熟溫度、時間對牦牛乳硬質干酪抑制金黃色葡萄球菌的效果顯著（P＜0.05）。

結合圖1和圖2，在成熟時間較短時，提高成熟溫度，干酪水溶性多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果增加明顯，而成熟時間較長時，提高成熟溫度后，干酪水溶性多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果增加減緩。比較圖1、圖2發現，干酪水溶性多肽對大腸桿菌的抑制效果強于金黃色葡萄球菌。

2.4 成熟條件對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制ACE活性的影響

由于ACE活性的增強能夠導致機體血壓升高，因此本試驗通過間接測定抑制ACE活性的效果來評價干酪水溶性多肽的降血壓作用。不同成熟溫度及時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制ACE活性的結果見圖3。

圖3 成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制血管緊張素轉換酶活性的影響Fig.3 Effect of ripening temperature and time on angiotensin converting enzyme inhibitory activity of soluble peptides in hard cheese made by yak milk

從圖3可知，5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬質干酪，在4～6個月成熟過程中，其水溶性多肽對ACE的抑制率均呈現先減小后增大趨勢，且5℃、10℃、15℃成熟6個月干酪的水溶性多肽對ACE的抑制率比相同溫度成熟4、5個月干酪都高。SAITO T等[20]發現成熟24個月的Gouda干酪中ACE抑制活性（78.2%）強于成熟8個月的Gouda干酪（75.5%）。15℃成熟5個月干酪的水溶性多肽對ACE的抑制率比相同溫度成熟4個月干酪顯著降低3.30%（P＜0.05），而5℃成熟5個月干酪的水溶性多肽對ACE的抑制率比相同溫度條件下4個月干酪顯著降低8.55%（P＜0.05）。

當成熟溫度從5℃提高至15℃時，干酪水溶性多肽對ACE抑制率呈現增加趨勢。15℃成熟4個月干酪的水溶性多肽的ACE抑制率顯著比5℃成熟相同時間干酪提高3.35%（P＜0.05），而15℃成熟6個月干酪的水溶性多肽的ACE抑制率顯著比5℃成熟相同時間干酪提高7.07%（P＜0.05）。這主要是由于高溫成熟的牦牛乳硬質干酪的蛋白質降解程度高于低溫成熟干酪[11]。ONG L等[21]報道了添加益生菌附屬發酵劑、8℃成熟12周的Cheddar干酪中ACE抑制作用顯著強于4℃成熟干酪。SAHINGIL D等[22]研究發現，用瑞土乳桿菌（Lactobacillus helveticus）作為附屬發酵劑，12℃成熟的鹽腌干酪具有較高的ACE-I抑制肽含量。方差分析顯示，成熟溫度、時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抑制ACE的作用顯著（P＜0.05）。

3 討論

生物活性肽的肽段在完整蛋白質中沒有活性，一旦被酶降解后，將產生活性。對干酪而言，由于成熟過程中蛋白質降解程度的不斷加深，產生的生物活性肽被進一步降解，從而導致其功能特性喪失[23]。本試驗發現成熟溫度和時間的變化引起牦牛乳硬質干酪水溶性多肽清除DPPH自由基、抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及ACE活性的能力發生變化。成熟溫度較高時，牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抗氧化活性達到較強的成熟時間縮短，而成熟溫度降低時，干酪水溶性多肽抗氧化作用達到較強的時間延長。成熟溫度從5℃提高至15℃時，干酪水溶性多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及ACE的抑制作用呈現增強趨勢，且與蛋白質降解程度顯現一定的相關性。

干酪成熟過程中蛋白質降解處于復雜的動態變化。隨著干酪中微生物的自溶[24]，部分生物活性肽又被降解。成熟6個月的Parmesan干酪中源自as1-酪蛋白降解的降血壓肽在成熟15個月干酪中未被發現[25]。干酪生物活性肽的產生與積累依賴于其成熟過程中蛋白質降解所產生的肽的形成與降解間的平衡。提高牦牛乳硬質干酪的成熟溫度導致干酪12%可溶性氮含量、親水性肽含量增多以及疏水性肽含量減少[11]，結合本試驗的研究結果，在干酪成熟過程中，提高成熟溫度能夠導致生物活性肽功能性強或者含量高的生物活性肽提前釋放。但是，具體生物活性肽的結構特征和性質還有待于下一步研究。

4 結論

經不同溫度和時間成熟的牦牛乳硬質干酪的水溶性多肽具有抗氧化、抑菌和降血壓特性，且成熟溫度和時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽的生物活性有較大影響。成熟溫度、時間對牦牛乳硬質干酪水溶性多肽的抗氧化作用具有極顯著影響（P＜0.01），對抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和ACE的影響顯著（P＜0.05）。5℃、10℃成熟5個月、15℃成熟4個月牦牛乳硬質干酪的水溶性多肽對DPPH自由基清除率分別達到最高。5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬質干酪水溶性多肽在4～6個月成熟過程中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制程度分別呈增強趨勢。成熟溫度從5℃提高至15℃時，牦牛乳硬質干酪水溶性多肽的抑菌程度和ACE抑制率呈增強趨勢。