利用一株凝結芽孢桿菌發酵酸解玉米秸稈生產乳酸

倪志華，張玉明*

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

乳酸是一種重要的有機酸，以乳酸為單體合成的聚乳酸生物塑料被認為是石化塑料的最佳替代品之一，利用可再生生物質生產乳酸可實現資源綠色循環應用[1]。我國是農業大國，玉米秸稈資源豐富，利用玉米秸稈生物煉制乳酸，不但可以降低原料成本、實現農業廢棄物綠色利用，而且可以解決秸稈丟棄、焚燒造成的環境污染問題[2-3]。

微生物是生物煉制的主要參與者，根霉菌和乳酸細菌是研究最多的乳酸生產菌。劉占英等[4]對一株可直接降解纖維素生產乳酸的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）進行紫外誘變育種，該菌株可利用玉米秸稈獲得0.63 g/L乳酸。李鑫等[5]以米根霉（Rhizopus oryzae）為菌種，生物轉化經汽爆和堿處理后玉米秸稈酶解液（含有葡萄糖100 g/L），最終獲得69.15 g/L乳酸。對乳酸生物煉制過程優化可降低生產成本，提高乳酸生產效率。王剛等[6]使用左旋乳酸芽孢桿菌W-1開展了玉米秸稈同步糖化發酵（simultaneous saccharificationandfermentation，SSF）產乳酸研究，在90g/L葡萄糖基質中添加高溫蒸煮的玉米秸稈和纖維素酶300U/L，經過6 d發酵可獲得72 g/L乳酸。陳曉佩等[7]對米曲霉進行細胞固定化處理，將濃縮的玉米秸稈酸爆液（含有葡萄糖60 g/L）轉化為乳酸36.4 g/L，糖酸轉化率63.5%。

目前，利用秸稈生物煉制乳酸存在菌種適應性差、原料利用率低、糖酸轉化率低等技術難題，尚未實現工業化生產[8]。針對上述問題，本研究以一株凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）為菌種，開展玉米秸稈生物煉制乳酸研究。借助該菌株高溫發酵、己糖/戊糖高效利用等特點，以期建立一種利用酸解玉米秸稈發酵生產乳酸新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈：采集于河北省保定市東金莊村農田；纖維素酶（25FPU/mL）：寧夏夏盛集團；β-葡萄糖苷酶（593CBU/mL）：丹麥諾維信公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖（純度均為99%），L-乳酸鈉（純度98%）：阿拉丁公司；其余化學試劑均為分析純。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635（以下簡稱菌株BCO）：本實驗室保存。發酵培養基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BLBIO-7GC發酵罐：上海佰倫公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；MLS-3750全自動滅菌鍋：日本三洋公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所。1.3方法

1.3.1 菌株BCO混合糖發酵實驗

由于玉米秸稈等木質纖維素水解液中可發酵糖類主要為葡萄糖、木糖和阿拉伯糖[2]，本實驗首先考察菌株BCO利用混合糖發酵乳酸能力。分別向發酵培養基中添加總質量濃度為60 g/L的混合糖，其中A組為20 g/L葡萄糖+33 g/L木糖+7g/L阿拉伯糖，B組為30g/L葡萄糖+25g/L木糖+5g/L阿拉伯糖。乳酸發酵實驗在發酵罐中進行，培養條件為50℃、100 r/min、pH 6.0。

1.3.2 玉米秸稈預處理和酶解實驗

玉米秸稈洗凈、烘干、粉碎，過80目篩，以1∶8（mg∶L）的固液比置于2%硫酸溶液中，混勻后121℃濕熱處理90 min，5 000 r/min離心15 min獲得的上清液定義為酸水解液；離心獲得的沉淀使用水洗滌至中性，烘干至質量恒定，定義為水不溶物（water insoluble solid，WIS）。將WIS用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.8）溶解，添加纖維素酶后在50℃、200r/min條件下進行酶解實驗。為了避免酶解產物纖維二糖的抑制作用，酶解時加入20CBU/g纖維素的β-葡萄糖苷酶。

1.3.3 糖化發酵

將斜面培養的菌株BCO接種到含有20 g/L葡萄糖的發酵培養基中，45℃、100 r/min培養6 h，制備BCO種子培養液。將干質量為100g的玉米秸稈使用1.3.2方法進行預處理，將預處理后的料液pH值調整為5.0后加入終濃度2%的酵母粉和BCO種子培養液進行發酵實驗（接種量為5%）。當料液中葡萄糖質量濃度＜1.0g/L時，加入纖維素酶開啟SSF生產乳酸實驗。當發酵體系中乳酸濃度不再增加時，加入WIS粉末40 g和纖維素酶進行補料實驗以提高產物乳酸濃度。SSF在發酵罐中進行，培養條件為50℃、100 r/min、pH5.0。上述方法中纖維素酶添加量均為20 FPU/g纖維素。

1.3.4 測定方法

發酵液中糖和產物濃度：使用高效液相色譜儀測定[9]；玉米秸稈中纖維素含量：采用美國國家可再生能源實驗室（nationnal renewable energy laboratory，NREL）推薦的方法測定[10]；L-乳酸含量：由生物傳感分析儀測定；發酵產物中L-乳酸的光學純度計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 菌株BCO對混合糖的利用

圖1 不同碳源比例對菌株BCO發酵生產乳酸的影響Fig.1 Effect of different carbon source ratio on lactic acid productionby strain BCO

由圖1可知，當使用A組碳源時，菌株BCO對葡萄糖和木糖的利用幾乎是同步的，發酵開始16 h后，碳源耗盡；使用B組碳源時，菌株BCO首先利用葡萄糖，再利用木糖和阿拉伯糖，發酵過程持續到20 h時碳源耗盡。這種優先利用葡萄糖，再依次利用其他碳源的現象，稱為碳源代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效應[11]。CCR效應會嚴重降低混合糖利用速度，導致發酵時間延長。因此，針對解除CCR效應的研究工作有很多報道，涉及菌種遺傳改造[12]和發酵策略設計[13]。本研究顯示，菌株BCO在利用混合糖時存在CCR效應，并且糖濃度比例變化也會影響菌株的糖利用模式。使用A組碳源和B組碳源所獲得產物乳酸的終質量濃度分別為（50.54±1.42）g/L和（51.04±1.23）g/L，糖酸轉化率分別為（0.92±0.02）g/g和（0.93±0.02）g/g。該結果說明，BCO能夠同型發酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生產乳酸，且具備高溫發酵特點，非常適合SSF工藝。

2.2 利用玉米秸稈酸水解液發酵生產乳酸

通常木質纖維素經預處理后產生糠醛、乙酸等副產物會對微生物生長產生強烈的抑制作用，甚至會影響其對底物的轉化效率[14]。

玉米秸稈經預處理，所得玉米秸稈稀酸水解液中含有混合糖（葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L）和一定量的發酵抑制物（乙酸（2.01±0.12）g/L，甲酸（0.04±0.01）g/L，糠醛（0.02±0.01）g/L，5-羥甲基糠醛（0.03±0.02）g/L）。由圖2可知，由于料液中存在一定量的抑制物，接種開始8h后菌株BCO才開始利用其中的糖基質生產乳酸，發酵24h后獲得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸轉化率為（0.93±0.02）g/g。表明菌株BCO對玉米秸稈酸水解液中混合糖實現了同型乳酸發酵，且預處理產生的副產物未對發酵過程產生明顯影響。

圖2 菌株BCO發酵玉米秸稈酸水解液生產乳酸Fig.2 Production of lactic acid from corn stalk acid hydrolysate by strain BCO

2.3 玉米秸稈WIS的纖維素酶解

使用100g玉米秸稈酸解后獲得WIS的干質量為（58.72±2.16）g，以其為底物考察纖維素酶添加量對酶解效率的影響（固液填充比率為5.87%），酶解結果見表1。

表1 纖維素酶添加量對酶解效率的影響Table 1 Effect of cellulase addition on enzymatic hydrolysis efficiency

由表1可知，隨著纖維素酶添加量的增加，酶解時間不斷縮短，并且酶解產物葡萄糖的質量濃度也逐漸升高。纖維素酶添加量達到20 FPU/g時，酶解時間縮短至30 h，酶解產物葡萄糖的質量濃度增至22.26 g/L；繼續增加纖維素酶添加量，酶解時間及酶解產物變化不大。因此綜合酶解效率和纖維素酶成本考慮，20 FPU/g纖維素酶+20 CBU/g β-葡萄糖苷酶是玉米秸稈WIS的最佳酶用量，此時玉米秸稈WIS的酶解效率為（63.54±2.03）%。該結果也說明2%硫酸預處理方法可以使玉米秸稈中纖維素充分暴露，被纖維素酶水解。

2.4 菌株BCO利用酸水解玉米秸稈SSF發酵生產乳酸

菌株BCO具備纖維二糖的利用能力[9]，因此SSF過程無需額外添加β-葡萄糖苷酶，菌株BCO利用酸水解玉米秸稈SSF發酵生產乳酸過程曲線見圖3。

圖3 菌株BCO利用玉米秸稈固態發酵生產乳酸過程曲線Fig.3 Curve of lactic acid production from corn stalk by strain BCO with solid-state fermentation

由圖3可知，由于酶解作用，發酵體系中葡萄糖和纖維二糖濃度迅速增高。但是隨著菌株BCO的生長，葡萄糖和纖維二糖逐漸被轉化為乳酸，酶解產物抑制被有效緩解。葡萄糖和纖維二糖是纖維素酶解的兩個最重要抑制物，菌株BCO可將上述兩種碳源發酵生成乳酸，不僅提高了SSF效率，并且可降低纖維素酶使用量[15-16]。在發酵開始65 h后，料液中基質幾乎消耗完全，乳酸含量為（38.38±1.03）g/L。此時100 g玉米秸稈生物轉化得到乳酸（40.19±1.22）g，L-乳酸光學純度為（99.23±0.22）%。與其他中溫菌SSF發酵過程相比，BCO生長溫度與商品纖維素酶最佳活力溫度相一致，纖維素酶的活性得到全部發揮，因此發酵過程更為高效[8]。乳酸生物煉制時，受限于原料預處理填充率問題，不能獲得高濃度的糖，因此產物乳酸濃度偏低[17]。針對此問題，有研究使用汽爆[18]等高效的原料預處理方法或者改進纖維素酶解工藝，可獲得到高濃度的可發酵糖類[19]。當然，進行SSF發酵時采用補料工藝也可獲得濃度產物[20-21]。本研究在SSF發酵進行至65 h時和100 h時，分別補加了玉米秸稈WIS干粉40g和纖維素酶（補加量為20FPU/g纖維素）。由于補加了底物和酶，BCO進行了“二次發酵”，玉米秸稈WIS酶解產物（葡萄糖和纖維二糖）被持續利用。發酵至135h后，產物乳酸含量達到（82.56±1.28）g/L。借助菌株BCO和工藝優化，本研究建立的玉米秸稈生物煉制乳酸方法，可將原料酸解/酶解獲得的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖高效轉化生成乳酸，省去了料液脫毒和WIS與玉米秸稈酸解液分別發酵的多步工藝單元。

3 結論

凝結芽孢桿菌BCO具有高溫生長，同型發酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生產乳酸能力，是一株良好的乳酸生物煉制菌。本研究使用的2%硫酸預處理工藝可酸解100 g玉米秸稈生成葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L。以其為發酵培養基碳源，菌株BCO可發酵獲得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸轉化率（0.93±0.02）g/g。進一步開展玉米秸稈SSF研究，原料經酸水解后無需固液分離，調整pH值后以20 g/L酵母粉為氮源，添加纖維素酶20 FPU/g纖維素后發酵生產乳酸，65 h后可獲得乳酸（38.38±1.03）g/L，其中L-乳酸光學純度為（99.23±0.22）%。為了提高產物濃度，向發酵體系補加玉米秸稈WIS和纖維素酶，最終獲得乳酸（82.56±1.28）g/L。