高產(chǎn)核酸的熱帶假絲酵母誘變選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化

岳秀宏，劉書宇，萬 霞，3，4*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所，湖北 武漢 430062；

2.上海大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海 200444；

3.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢 430062；

4.油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430062）

通過酵母發(fā)酵法制備核酸是目前核酸工業(yè)生產(chǎn)的主要方法，以核酸為原料通過分解法生產(chǎn)核苷酸已被廣泛應(yīng)用[1]。核酸是一種大分子物質(zhì)，幾乎參與生物體內(nèi)所有的生化過程[2]。而核苷酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，具有重要的生物學(xué)功能。大量臨床研究和試驗數(shù)據(jù)表明，酵母核苷酸具有增強免疫[3]、抗氧化[4]，維持腸道正常菌群的消化和吸收[5]，促進細胞和組織再生與修復(fù)的功能[3]。

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）是重要的工業(yè)酵母，是生產(chǎn)長鏈二羧酸[6]、木糖醇[7]和羥基還原酶[8]等工業(yè)原料的主要生產(chǎn)菌，也是利用低成本工業(yè)廢棄物生產(chǎn)單細胞蛋白的重要微生物[9]。熱帶假絲酵母還是酵母核酸發(fā)酵工業(yè)重要的菌株來源，從熱帶假絲酵母提取的核酸廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)[10-12]。熱帶假絲酵母耐糖、耐高溫、耐酸、生長速度快的生理性質(zhì)使之成為發(fā)酵生產(chǎn)核酸的優(yōu)良菌株。目前，從自然界分離、篩選仍然是獲得熱帶假絲酵母工業(yè)用菌株的主要方法，基因工程或基因編輯改造手段和法規(guī)尚不完善，多數(shù)研究仍集中于工藝條件優(yōu)化[10-12]。

電子束輻射是一種安全性高和可控性強的電離輻射技術(shù)，其沒有輻射源，不會殘留有害物質(zhì)對環(huán)境造成污染。電子加速器產(chǎn)生的電子束可以破壞生物細胞的DNA，或者輻射水和小分子產(chǎn)生-H、-OH等活性自由基，這些自由基導(dǎo)致細胞被氧化，對生物體（微生物等）造成不可彌補的損傷。研究者將電子束輻射運用于誘變育種，在很多植物表現(xiàn)了良好的誘變效應(yīng)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)電子束輻射誘變具有輻射生理損傷小、突變頻率高、突變譜寬等特點，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ恼T變技術(shù)。但應(yīng)用于微生物的相關(guān)研究較少[15-17]。Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗結(jié)合響應(yīng)面等方法是廣泛使用的工藝優(yōu)化方法，可以快速、準(zhǔn)確、有效地預(yù)測發(fā)酵過程中的顯著影響因子、最佳水平范圍及最優(yōu)條件[18-20]。

本研究以目前核酸工業(yè)發(fā)酵最高水平菌株，核酸含量為15%～17%的熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）HY4-17為出發(fā)菌株，采用電子束輻射技術(shù)進行誘變育種，以期篩選得到高產(chǎn)核酸的菌株。擬在獲得正向突變株的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗確定發(fā)酵參數(shù)中顯著影響核酸含量的因素，再設(shè)計最陡爬坡試驗，獲得核酸最大產(chǎn)量區(qū)域，應(yīng)用中心組合設(shè)計（centralcomposite design，CCD）響應(yīng)面分析法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基；并優(yōu)化接種量縮短發(fā)酵時間，以期獲得該突變株在實驗水平的最佳核酸發(fā)酵條件，為工業(yè)化發(fā)酵酵母核酸提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）HY4-17：湖北海宜生物科技有限公司保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、蔗糖、甘油、硫酸銨、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸、鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、高氯酸、酵母抽提物、蛋白胨（均為分析純或生化試劑）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YEPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂2 g/L。

種子培養(yǎng)基[21]：蔗糖20 g/L，酵母提取物20 g/L，硫酸銨2 g/L，硫酸鋅0.06 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.05 g/L，磷酸1 mL/L，用磷酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜45g/L，硫酸銨2g/L，硫酸鋅0.05 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.05 g/L，磷酸1 mL/L，用磷酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至4。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃、15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162型電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；GJ-2-Ⅱ電子加速器：上海先鋒電機廠；ZHJH-1112型超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；Molecular Devices M2多功能酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計：德國賽多利斯股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

菌種活化：從-80℃冰箱凍存管中挑取少量菌體加入裝有5 mL種子培養(yǎng)基的玻璃試管中，30℃、120 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)：從活化好的試管中接種1 mL種子液到裝液量為100 mL/500 mL種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h左右，菌種達到對數(shù)期，用于搖瓶發(fā)酵。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法：接種3%的種子培養(yǎng)液于裝液量為30 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 核酸分析檢測

使用酶標(biāo)儀測定OD562nm值；核酸產(chǎn)量測定參照文獻[22]的高氯酸法略作修改：取對數(shù)中期的酵母菌液2mL于A、B兩個試管中，4000r/min離心10min，A管置于60℃烘箱中烘干稱質(zhì)量，B管倒掉上清，加1mL生理鹽水重懸，以4000r/min離心10 min，將上清盡量取干凈，加入10%的高氯酸2 mL，置于70℃的水浴鍋中加熱20 min，期間每隔4～5 min上下顛倒試管混勻，然后置于冰上冷卻，以10 000 r/min離心10 min。取100 mL上清液加入4.9 mL的無菌水中，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在波長260nm處測定吸光度值，空白為100 μL 10%的高氯酸加入4.9 mL的無菌水中。核酸含量及核酸產(chǎn)量計算公式如下：

Y=m/2×X

式中：X為核酸含量，%；Y為核酸產(chǎn)量，mg/mL；A為波長260nm處樣品的吸光度值；50為稀釋倍數(shù)；2為高氯酸體積，mL；m為2 mL菌液所得菌體質(zhì)量，mg；26為1 mL/mg核酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值；m/2為生物量，mg/mL。

1.3.3 電子束輻射誘變

電子束輻照誘變熱帶假絲酵母的最大束功率為2.0MeV，50kW，每次實驗輻射能量保持在1.8MeV。取10mL對數(shù)中后期的菌懸液裝于已滅菌的透明培養(yǎng)袋中，密封用于輻照。熱帶假絲酵母輻照劑量分別為0.5 kGy、1.0 kGy、1.5 kGy、2.0kGy、3.0kGy、4.0kGy，以未照射的假絲酵母作為對照組。樣品處理完畢后，分別用生理鹽水稀釋，涂布到固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)48 h，計算菌株致死率，其計算公式如下：

1.3.4 突變菌株的篩選

初篩挑取誘變后較大的單菌落于加入裝有5 mL種子培養(yǎng)基的玻璃試管中28℃、120 r/min，過夜振蕩培養(yǎng)活化。采用1.3.1的菌種培養(yǎng)方法擴大并發(fā)酵8 h，選擇OD562nm值＞0.6的突變株，根據(jù)1.3.2核酸測定方法測定核酸含量，選取核酸含量提高10%以上的突變株復(fù)篩。復(fù)篩菌株培養(yǎng)方法及核酸含量測定方式同初篩。

1.3.5 突變菌株的生長曲線

接種3%的種子培養(yǎng)液于裝液量為30 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)，每隔2 h使用酶標(biāo)儀檢測OD562nm值，以時間為橫坐標(biāo)，OD562nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，根據(jù)生長曲線選擇生長速率最快的突變株，及確定突變株的生長周期。

1.3.6 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將經(jīng)過誘變復(fù)篩得到的高產(chǎn)核酸的突變株在YEPD培養(yǎng)基平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接8代，進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定對數(shù)中期核酸含量，檢測菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

選用N=12的Plackett-Burman兩水平法對影響核酸產(chǎn)量的7種因素進行考察[21]，篩選出對核酸產(chǎn)量有顯著作用的因素。使用Minitab 18.0軟件進行Plackett-Burman試驗設(shè)計，試驗因素與水平見表1，其中“-1”表示低水平，“1”表示高水平。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design

（2）最陡爬坡試驗

依據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，將顯著影響核酸產(chǎn)量的因素：糖蜜、硫酸銨、pH，進行最陡爬坡優(yōu)化。依據(jù)效應(yīng)分析，以表1初始水平“0”為起點，正顯著因素逐步提高含量，負顯著影響因素逐步降低含量，其他非顯著影響因素取初始水平，獲得核酸含量最大時相應(yīng)的糖蜜、硫酸銨、pH值。

（3）響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過最陡爬坡試驗獲得核酸最大產(chǎn)量區(qū)域后，根據(jù)中心點確定顯著因子的高、中、低水平，分別以-2、-1、0、1、2編碼，響應(yīng)面試驗因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests

1.3.8 接種量和發(fā)酵時間對核酸產(chǎn)量的影響

使用響應(yīng)面優(yōu)化得到的培養(yǎng)基，分別接種3%、5%、8%、10%、12%的種子培養(yǎng)液于裝液量為30 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220r/min培養(yǎng)，分別于6 h、8 h、12 h、16 h、18 h檢測核酸產(chǎn)量及生物量。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，每組試驗進行3個重復(fù)，取3個重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻射誘變

參考前期文獻對銅綠微囊藻的[17]誘變劑量，及電子加速器劑量限制條件（輻射劑量最低為0.5 kGy可保障其準(zhǔn)確性），輻照劑量分別為 0.5 kGy、1.0 kGy、1.5 kGy、2.0 kGy、3.0kGy、4.0kGy，以未照射的假絲酵母HY4-17作為對照組。誘變處理完畢后，分別用生理鹽水稀釋，涂布到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)48 h，結(jié)果見圖1。

圖1 誘變菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of mutant strains

由圖1可知，經(jīng)0.5 kGy劑量電子束輻射處理后稀釋10-5平均存活48個單菌落，菌落形態(tài)較為均一，為乳白色球狀，大小與出發(fā)菌株相近。分析致死率，0.5 kGy劑量為98%，輻照劑量≥1.0 kGy致死率接近100%。據(jù)文獻報道[23]，當(dāng)致死率為85%～95%時，可獲得較高的正突變率。選擇致死率最低接近95%的0.5 kGy劑量篩選突變株。

2.2 突變菌株的篩選結(jié)果

本研究對0.5 kGy誘變劑量YEPD固體培養(yǎng)基挑選出的100個較大單菌落菌種培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)8 h，生長較快即OD562nm值＞0.6的33株突變株測定核酸含量，結(jié)果見圖2。

圖2 電子束誘變初篩及復(fù)篩結(jié)果Fig.2 Preliminary and secondary screening results after electron beam mutagenesis

由圖2A可知，篩選到15株核酸含量高于原始菌株HY4-17的突變株，其中7株菌株的核酸含量提高10%以上，顯著高于HY4-17。選擇這7株突變株進行復(fù)篩，圖2B可知，復(fù)篩得到4株核酸含量顯著提高的突變株，其中突變株EBI-21和EBI-22核酸含量最高，均達到20.8%，比出發(fā)菌株提高了25%。因此，選擇菌株EBI-21和EBI-22作為為進一步研究的菌株。

2.3突變菌株的生長曲線

由于酵母核酸含量在對數(shù)生長期最高，隨發(fā)酵時間延長會不斷降低，最終達到穩(wěn)定。選擇生長速率快且核酸含量高的菌株尤為重要。以原始菌株HY4-17為對照，實驗進一步研究了突變株EBI-21和EBI-22的生長曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，3株菌在0～4 h為遲緩期，4～14 h為對數(shù)生長期，14～18h為穩(wěn)定期，OD562nm值=0.6為對數(shù)中期。培養(yǎng)8 h，出發(fā)菌株HY4-17、突變菌株EBI-21和EBI-22的OD562nm值分別達到0.6、0.8和0.7，突變菌株EBI-21和EBI-22生長速率明顯優(yōu)于出發(fā)菌株HY4-17，更早的進入對數(shù)中期。而突變菌株EBI-21則是生長速率最快的菌株，培養(yǎng)7h，其OD562nm值達到0.6，比出發(fā)菌株HY4-17提前1h進入對數(shù)中期。突變菌株EBI-22約培養(yǎng)7.8h，OD562nm值達到0.6。因此，菌株EBI-21作為進一步研究的出發(fā)菌株。

圖3 菌株EBI-21和EBI-22的生長曲線Fig.3 Growth curves of strain EBI-21 and EBI-22

2.4 突變株EBI-21的遺傳穩(wěn)定性

突變株的遺傳穩(wěn)定性對于菌株的應(yīng)用至關(guān)重要。對篩選出的突變菌株EBI-21進行遺傳穩(wěn)定性實驗。連續(xù)傳代8代，測定其每代搖瓶發(fā)酵核酸含量，結(jié)果見表3。

表3 菌株EBI-21多次傳代后對核酸含量的影響Table 3 Effect of multiple passage of strain EBI-21 on nucleic acidcontent

由表3可知，突變菌株EBI-21經(jīng)過8代遺傳穩(wěn)定性試驗，核酸含量維持在（18.7±1.5）%～（20.8±1.0）%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，傳代2～8次與第一代相比，差異不顯著（P＞0.05），表明突變菌株EBI-21遺傳穩(wěn)定性良好。因此，以EBI-21為出發(fā)菌優(yōu)化發(fā)酵條件，進一步提高核酸產(chǎn)量。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.5.1 Plackett-Burman試驗

盡管酵母核酸含量隨發(fā)酵時間延長會不斷降低[24]，而隨生物量的增加，核酸產(chǎn)量隨時間延長在不斷增加。在優(yōu)化培養(yǎng)基之前，預(yù)實驗以EBI-21為出發(fā)菌，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)22 h核酸產(chǎn)量達到最高。

Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果見表4，用Minitab18.0軟件對表4試驗數(shù)據(jù)進行處理，并進行各因素效應(yīng)分析，結(jié)果見表5。由表5可知，糖蜜、硫酸銨、pH對核酸的產(chǎn)量具有顯著性影響（P＜0.05），由P值可知，影響效應(yīng)依次為糖蜜＞pH值＞硫酸銨。糖蜜和硫酸銨對核酸產(chǎn)量的影響呈正效應(yīng)，pH值對核酸產(chǎn)量的影響呈負效應(yīng)。

表4 Plackett-Burman設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

表5 Plackett-Burman試驗因素水平及效應(yīng)分析Table 5 Factor,levels and effect analysis of Plackett-Burman tests

2.5.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗結(jié)果的效應(yīng)分析，通過最陡爬坡試驗分別優(yōu)化糖蜜，硫酸銨及pH值，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。由表6可知，當(dāng)糖蜜質(zhì)量濃度為165 g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度為3 g/L，pH值為4時，核酸產(chǎn)量最高，因此選為中心點，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

2.5.3 響應(yīng)面試驗預(yù)測最優(yōu)培養(yǎng)基

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果分析，結(jié)合試驗需要，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果表7，非顯著因子選用PB試驗“0”對應(yīng)的水平。將中心點設(shè)為糖蜜為165g/L，硫酸銨為3g/L，pH值為4。響應(yīng)面二次回歸模型方差分析結(jié)果見表8。

表7 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of response surface tests

通過Design Expert分析軟件對表8數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到核酸產(chǎn)量（Y）對糖蜜（A）、硫酸銨（B）及pH值（C）的二次回歸方程如下：

Y=1.46+0.086A+0.026B+0.057C-0.004 34AB+0.047AC-

0.020 BC-0.003 75A2-0.005 44B2-0.021C2

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

由表8可知，模型的P值＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項的P值為0.064 9＞0.05，表明差異不顯著，殘差由隨機誤差引起，可以判定該模型與樣本具有較高的相關(guān)性。一次項A、B、C，交互項AC、BC，二次項C2對核酸產(chǎn)量均有極顯著性影響（P＜0.01）。決定系數(shù)R2=0.993 8，說明模型擬合性較好，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.985 8，說明該模型能解釋98.58%的響應(yīng)值變化，表明該模型可行度高。

通過Minitab軟件對回歸方程計算，預(yù)測核酸含量最高時各因素水平如下：糖蜜185g/L，硫酸銨3g/L，pH值為4.5，核酸產(chǎn)量理論預(yù)測值為1.63 g/L。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，獲得的核酸產(chǎn)量平均值為1.64 g/L，與理論預(yù)測值接近，說明該模型可行。

2.6 接種量對發(fā)酵時間和核酸產(chǎn)量的影響

除優(yōu)化培養(yǎng)基外，還探索了最適接種量對培養(yǎng)時間及核酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，核酸產(chǎn)量隨時間延長而升高，達到穩(wěn)定期不再增長，接種量為8%，核酸產(chǎn)量在12 h時達到最高，為1.73 g/L。接種量為3%和5%時，核酸產(chǎn)量分別在16 h、18 h時達到最高，相比接種量為8%時發(fā)酵時間增加4～6 h。所以相對較高的接種量能縮短發(fā)酵時間，但不影響核酸產(chǎn)量，并節(jié)約生產(chǎn)成本，利于工業(yè)生產(chǎn)。

圖4 不同接種量對發(fā)酵時間和核酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inoculum on fermentation time and nucleic acid production

3 結(jié)論

本研究采用電子束輻射誘變技術(shù)對高產(chǎn)核酸的熱帶假絲酵母HY4-17菌株進行處理，在0.5 kGy劑量誘變單菌落中成功地篩選得到核酸含量高達20.8%的突變株，比出發(fā)菌株提高了25.9%，是目前報道的菌株中核酸含量最高的。突變株EBI-21的生長速率明顯提高，可提前1 h進入對數(shù)中期。通過PB試驗，最陡爬坡試驗及CCD試驗等手段優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基優(yōu)化后組成為糖蜜185 g/L，硫酸銨3g/L，硫酸鋅0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.05g/L，磷酸1 mL/L，pH值為4.5。除了優(yōu)化培養(yǎng)基，還探索了最適接種量。最優(yōu)接種量為8%，發(fā)酵時間為12 h。在此優(yōu)化條件下，核酸產(chǎn)量達到1.73g/L，與初始培養(yǎng)條件相比提高了80.21%，培養(yǎng)時間縮短了10 h。