lncRNA GAS5通過靶向miR-221抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲

王耀宗 孫乃坤 葉桂峰 楊鑌 張英

(廈門大學 1附屬中山醫院骨科，福建 廈門 361003；2附屬第一醫院脊柱外科)

骨肉瘤(OS)也稱為成骨肉瘤，是一種常見的原發性成骨性實體惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤發生率的2.4%〔1，2〕。據報道，超過30%的OS患者可出現癌細胞肺、胸膜和心臟轉移，極大程度上加大了OS的治療難度，導致患者5年生存率僅為40%～75%〔3，4〕。目前，臨床中常采用放療、化療、手術切除治療，但對轉移性或復發性OS患者治療效果不理想，極易產生不良預后〔5，6〕。

LncRNAs是一類超過200個核苷酸長度的長鏈非蛋白編碼RNAs，最早被認為是基因轉錄的“噪音”，但近年來研究表明，部分lncRNAs可通過再轉錄或轉錄后水平調控基因的表達參與機體內多種生物學過程，如細胞周期、分化、增殖、凋亡等〔7〕。研究證實，在多種癌癥組織或細胞中均出現lncRNAs的異常表達，失調的lncRNAs通過調控腫瘤相關因子表達發揮致癌或腫瘤抑制作用〔8〕。生長停滯特異性轉錄因子(GAS)5是最早在小鼠生長停滯的成纖維細胞中被發現的lncRNA，定位于人染色體1q25.1上。大量研究顯示，該lncRNA在多種人類腫瘤中發揮重要的腫瘤抑制作用〔9～11〕，但其在OS發展中的功能和機制還有待深入研究。本研究分析GAS5在OS細胞中的表達及對OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并深入探究GAS5調控細胞功能的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 細胞學實驗于2017年6月至2018年3月在廈門大學附屬中山醫院病理科完成。人胚胎腎細胞293T和人成骨細胞hFOB 1.19(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；OS細胞U2OS(美國ATCC)；胎牛血清，DMEM培養基，McCoy 5A培養基，胰蛋白酶(美國Gibco)；Lipofectamine 2000 Reagent,High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,MicroRNA Reverse Transcription Kit,Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)(美國ThermoFisher),Dual-Luciferase? Reporter Assay System(美國Promega)；點突變試劑盒(日本Takara)；Transwell細胞小室(孔徑8 μm)(美國Corning)；Matrigel基底膜基質(美國BD Biocoat)；噻唑藍(MTT)細胞增殖試劑盒、總RNA提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；pcDNA-GAS5重組質粒(GAS5)及對照質粒(pcDNA3.1)，GAS5小干擾RNA(si-GAS5)及干擾對照(si-NC),miR-221模擬物(miR-221)及相應的陰性對照(miR-NC),miR-221抑制劑(anti-miR-221)及相應的陰性對照(anti-miR-NC),含miR-221結合位點的野生型GAS5熒光素酶報告質粒(GAS5-WT)和miR-221結合位點突變的突變型GAS5熒光素酶報告質粒(GAS5-MUT,上海吉瑪制藥技術有限公司)。

1.2細胞培養 293T和hFOB 1.19細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM基礎培養液中，U2OS細胞培養在含10%胎牛血清的McCoy 5A培養基中。將上述細胞置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，每隔2 d更換一次培養基，至細胞融合度達85%時，進行后續細胞實驗。

1.3細胞轉染 將上述處于對數生長期的細胞接種于6孔板中，過夜培養至細胞融合度達50%時，利用Lipofectamine 2000將上述質粒或寡核苷酸轉染到細胞中，持續培養48 h后，進行后續實驗操作。

1.4qRT-PCR檢測GAS5和miR-221表達 利用總RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度后分別利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit和MicroRNA Reverse Transcription Kit將GAS5和miR-221逆轉錄成cDNA。miR-221-RT：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUU-UC；U6-RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAATAGTGAAC。以cDNA為模板，利用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)配制qPCR反應體系，之后在熒光定量PCR儀上測定GAS5和miR-221的相對表達水平，分別以GAPDH和U6 snRNA作為內參，結果按照2-ΔΔCt公式計算。GAS5上游引物：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，下游引物：5′-TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；miR-221上游引物：5′-CAGCATACATGAT TCCTTGTGA-3′，下游引物：5′-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3′；U6上游引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.5MTT法檢測細胞的增殖活性 將轉染后的U2OS細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設3個重復樣品，分別在轉染后24、48、72 h加入MTT試劑，37℃、5% CO2條件下孵育4 h后，加入Formazan溶解液，之后在酶標儀上測定570 nm處的吸光值。

1.6Transwell小室法檢測細胞侵襲和遷移 細胞遷移：將轉染48 h后的U2OS細胞用0.25%的胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用不含血清的培養基重懸細胞，并調整細胞密度為5×105/ml。取200 μl細胞懸液加入24孔板小室上室中，在下室內加入500 μl含10%胎牛血清的完全培養基，于37℃、5% CO2條件下培養48 h后取出，用棉簽擦去上室內的細胞，之后用0.1%結晶紫染液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察結果并拍照，隨機選取10個視野進行計數，并計算平均遷移細胞數。細胞侵襲實驗需要在上室中加入Matrigel以模仿細胞外基質，具體操作步驟同遷移實驗。

1.7雙熒光素酶報告分析 利用Lipofectamine 2000將構建的GAS5-WT/MUT重組質粒與miR-NC、miR-221、anti-miR-NC或anti-miR-221共轉染到293T細胞中，48 h后利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.8主要觀察指標 GAS5在OS細胞中的表達；GAS5對OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響及調控機制。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1GAS5在OS細胞U2OS中的表達 與正常hFOB 1.19組(1.008±0.002)相比，U2OS細胞中GAS5相對表達量(0.297±0.035)顯著降低(P<0.05)。

2.2GAS5過表達對U2OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 GAS5轉染組細胞中GAS5相對表達水平(3.251±0.326)顯著高于pcDNA轉染組(1.025±0.025，P<0.05)，說明通過轉染GAS5可建立GAS5過表達細胞模型。與pcDNA組相比，GAS5過表達的U2OS細胞在48 h和72 h的增殖活性明顯降低(P<0.05)；GAS5轉染后48 h，U2OS細胞的遷移和侵襲活性也明顯低于pcDNA轉染組(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 GAS5過表達抑制U2OS細胞遷移和侵襲

組別吸光度值24 h48 h72 h遷移數目(個)侵襲數目(個)pcDNA組0.202±0.0180.575±0.0250.916±0.05296.23±10.05109.54±10.21GAS5組0.211±0.023 0.337±0.0311) 0.448±0.0361)43.18±6.131)50.26±5.481)

與pcDNA組比較：1)P<0.05

2.3GAS5與miR-221靶向關系驗證 miR-221序列中存在與GAS5互補結合的位點，GAS5：5′-gauAUUCUGCAUUCCCAUGUAGCa-3′，miR-221:3′-cuuUGGGUCGU-CUGUUACAUCGa-5′。與miR-NC組相比，miR-221過表達明顯抑制GAS5-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，但對GAS5-MUT熒光素酶活性無影響(P>0.05)；與anti-miR-NC組相比，抑制miR-221表達明顯促進了GAS5-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，但對GAS5-MUT熒光素酶活性無影響(P>0.05)，見表2。

表2 miR-221過表達或敲低對GAS5WT/MUT報告質粒熒光素酶活性的影響

與miR-NC組比較：1)P<0.05；與anti-miR-NC組比較：2)P<0.05

2.4GAS5對miR-221表達的調控 與pcDNA組(1.015±0.002)相比，GAS5轉染的U2OS細胞中miR-221的相對表達量(0.248±0.014)顯著降低(P<0.05)；與si-NC組(0.986±0.013)相比，si-GAS5轉染的U2OS細胞中miR-221相對表達量(2.863±0.205)顯著升高(P<0.05)。

2.5miR-221在OS細胞U2OS中的表達 與正常hFOB 1.19組(1.000±0.003)相比，U2OS細胞中miR-221的相對表達量(3.213±0.033)顯著升高(P<0.05)。

2.6miR-221逆轉GAS5對U2OS細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用 與GAS5+miR-NC組相比，外源回補miR-221可顯著逆轉GAS5對U2OS細胞增殖的抑制作用(P<0.05)；與GAS5+miR-NC組相比，外源回補miR-221可逆轉GAS5對U2OS細胞遷移和侵襲的抑制作用(P<0.05)，見表3。

組別吸光度值24 h48 h72 h遷移數目(個)侵襲數目(個)pcDNA組0.213±0.0240.596±0.0551.037±0.176110.45± 12.39123.32± 12.68GAS5組0.208±0.0320.367±0.0411)0.492±0.0531)53.71 ± 5.731)63.41 ±6.531)GAS5+miR-NC組0.216±0.0210.343±0.0300.514±0.04458.52 ±6.0453.36 ±6.04GAS5+miR-221組0.227±0.020 0.569±0.0472) 0.936±0.0862)96.46 ±9.482)98.27 ±10.422)

與pcDNA組比較:1)P<0.05；與GAS5+miR-NC組比較:2)P<0.05

3 討 論

新型臨床輔助化療藥物的開發，極大程度地緩解了OS患者的病情發展〔12〕，然而，惡性腫瘤轉移仍然是導致OS患者治療失敗的主要原因〔13〕。隨著分子生物學技術的不斷發展，研究人員發現lncRNA在多種生物過程中發揮重要的調節作用，異常表達的lncRNA可能涉及多種人類疾病，特別是惡性腫瘤的發生發展，包括OS〔14，15〕。LncRNA GAS5在多種人類腫瘤中出現異常的低表達，并通過調控癌細胞的增殖、遷移、侵襲、細胞周期和凋亡等過程發揮腫瘤抑制功能。研究顯示，肝癌組織中低表達的GAS5可作為患者總體存活率的獨立預測因子，外源過表達GAS5可通過調控波形蛋白表達抑制體外肝癌細胞的增殖和侵襲〔16〕；在胰腺導管癌中GAS5表達水平顯著降低，體外功能實驗證實，下調的GAS5可通過誘導細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)6表達調控細胞周期并發揮對癌細胞增殖的促進作用〔17〕。本研究結果表明，lncRNA GAS5在OS中發揮腫瘤抑制作用。Ye等〔18〕證實，GAS5可通過抑制OS細胞生長和上皮間質轉化發揮抗腫瘤形成作用；Wang等〔19〕研究表明，OS細胞MG-63中下調的GAS5可促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，并促進細胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin B1、CDK1和CDK4表達，本研究結果與之相一致。

研究表明，lncRNA GAS5可發揮“分子海綿”的功能吸附miRNA，減少miRNA在特定組織或細胞中的表達，最終參與腫瘤的發生發展〔20〕。如GAS5可通過與miR-222互補結合，抑制膠質瘤細胞的生長、侵襲、遷移和凋亡〔21〕；此外，GAS5還可通過抑制miR-103表達促進其下游靶基因第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)水平的升高，進而延緩子宮內膜癌的發展〔22〕。本研究結果證實miR-221是GAS5的一個靶miRNA，GAS5能夠通過互補結合位點負調控miR-221表達。miR-221是一種常見的致癌因子，參與多種腫瘤的發生發展過程。如在胃癌卵巢轉移患者血清外泌體中，miR-221表達水平顯著升高，由此初步說明miR-221可能參與胃癌的卵巢轉移過程〔23〕；miR-221/222簇可通過調控PTEN/蛋白激酶B(Akt)信號通路活性促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔24〕。miR-221通過靶向抑制AT豐富結合域1A基因(ARID1A)增強宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力〔25〕。另外，本研究結果顯示，外源回補miR-221逆轉了GAS5對OS細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。綜上，GAS5在OS細胞中表達量降低，而miR-221表達量升高；過表達GAS5可通過靶向吸附miR-221抑制OS細胞的增殖、侵襲和遷移能力，在OS發展中起腫瘤抑制作用，提示GAS5具有作為OS新型腫瘤抑制劑的潛能。