大鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)方法改良與鑒定

黃可欣 于軍 石搏

(吉林大學基礎醫(yī)學院 1組織胚胎學教研室，吉林 長春 130021;2病原免疫細胞遺傳學實驗教學中心；3生物化學與分子生物學實驗教學中心)

骨髓組織中除含有造血干細胞外，還含有非造血干細胞也就是間充質干細胞(MSC)，它在骨髓中含量極少，臨床廣泛應用必須進行分離、純化及擴增〔1～3〕。MSC存在于骨髓基質中，20世紀70年代由Friedenstein提出，它最顯著的生物學特征是既有自我更新能力，又具有多分化潛能，且取材方便，易于體外分離及擴增〔4～6〕。以往研究對MSC采用離心法和貼壁法進行培養(yǎng)、分離、純化，本實驗對大鼠MSC的體外離心培養(yǎng)方法做了進一步改良，通過吸取沉淀層的不同，提高培養(yǎng)MSC純度和成功率。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級成年健康雄性Wistar大鼠，體質量200～250 g，由吉林大學基礎醫(yī)學部動物實驗中心提供(合格證號：960101032)；專人飼養(yǎng)，室溫22℃左右，取材處理符合動物倫理學標準。

1.2實驗試劑和儀器 依斯考夫改進的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM)購自GIBCO公司；胎牛血清、胰蛋白酶、抗生素購自四季清生物技術有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購于長春鼎國生物有限公司；Percoll分離液為Sigma公司產品；6孔培養(yǎng)板、25 cm2培養(yǎng)瓶為Coring產品；單克隆抗體CD29、CD44、CD34、CD45、膠原蛋白Ⅱ購自Santa Cruz公司；SP9710試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自福州邁新生物有限公司；CO2培養(yǎng)箱(香港力康生物醫(yī)療科技控股集團)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.3實驗動物取材 大鼠10%水合氯醛麻醉，然后拉頸處死，放入75%酒精浸泡5 min；移入超凈工作臺中，用無菌生理鹽水洗5 min；取出雙下肢，分離股骨表面肌肉，盡量保持雙股骨的完整性，無菌條件下分離大鼠股骨。

1.4骨髓腔細胞分離 無菌條件下將股骨移入Hank液浸泡(Hank液含雙抗100 U/ml)，取出股骨置于表面皿中，將股骨兩端剪去，用無血清IMDM沖洗骨髓腔，液體量為10 ml，反復沖洗3次，吸沖洗液至離心管中，再用無血清IMDM沖洗表面皿約4 ml，至終體積約15 ml，離心1 000 r/min，5 min，棄上清，用3 ml無血清IMDM重懸，加入另一含有3 ml Percoll液的離心管內，此時將兩管液體充分吹打混合、離心1 000 r/min、30 min(以往是兩管液體避免混合、離心2 000 r/min、20 min)，吸取中間白粉色的絮狀物(以往僅吸取乳白色單個核細胞層)，用無血清IMDM洗2次，每次10 ml液體、1 000 r/min、10 min離心，棄上清，再加15%胎牛血清的IMDM 15 ml，接種至25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。

1.5MSC培養(yǎng) 細胞以1×106/ml接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中后置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h可見細胞貼壁，此時首次換液(培養(yǎng)液為15%胎牛血清的IMDM)，然后每3 d換液1次(培養(yǎng)液為10%胎牛血清的IMDM)。約7 d細胞長滿瓶底，此時進行傳代培養(yǎng)，傳代用0.25%胰蛋白酶〔含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化5 min，胎牛血清終止消化，按此法反復傳代培養(yǎng)增殖。

1.6形態(tài)學觀察及MSC鑒定 用倒置相差顯微鏡逐日觀察。細胞傳代至第五代時，將一部分細胞接種于預先置入已涂多聚賴氨酸蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細胞鋪滿80%左右，用于檢測CD29、CD34、CD44、CD45、膠原蛋白Ⅱ細胞抗原分子。實驗步驟：Hank液洗蓋玻片5 min/次，3次；純丙酮固定20 min，晾干后蒸餾水洗5 min/次，3次；0.1%Triton-100作用10 min，然后按SP9710試劑盒操作，DAB顯色、蘇木精復染、脫水、樹膠封片。另一部分細胞計數(shù)2.0×105/ml，離心分裝入6支離心管內，各100 μl，每管分別加入CD29、CD34、CD44、CD45、膠原蛋白Ⅱ抗體及空白對照，避光孵育30 min，2 000 r/min離心5 min棄上清，用500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，置入流式細胞儀，檢測熒光標記的CD29、CD34、CD44、CD45、膠原蛋白Ⅱ細胞的純度。

2 結 果

2.1不同時間點MSC原代培養(yǎng)比較 接種后的細胞大而圓，折光性強，24 h后開始貼壁基本還保持圓形，略有突起伸出，未貼壁細胞在換液過程中逐步被清除，3 d后可見細胞分裂，增殖形成細胞團，7 d后細胞團內新生的細胞呈圓形，折光性很強，位于中心，周圍的細胞折光性減弱，可見細胞呈梭形，此時培養(yǎng)瓶內細胞呈團落樣生長，未見細胞團落連成片，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，3～4 d傳代一次，傳至第五代時可見細胞排列呈明顯輻射狀，旋渦狀，細胞呈梭形帶突起的嵌和(圖1)，此時細胞狀態(tài)最佳，可在這一代凍存(-80℃，1個月)，第六代以后細胞生長速度減慢，細胞內黑色顆粒狀物質逐漸增多，因此MSC最佳凍存時間是第五代細胞。

2.2免疫組化染色鑒定MSC的表型 細胞傳代至第五代時，進行免疫組化染色鑒定MSC的純度表型。特異性抗體CD29、CD44免疫細胞化學染色呈陽性反應(棕黃色)，特異性抗體CD34、CD45、膠原蛋白Ⅱ染色呈陰性反應；陰性對照均未著色，說明培養(yǎng)細胞為MSC而不是其他白細胞、成纖維細胞等。見圖2。

圖1 不同時間點MSC原代培養(yǎng)(×40)

圖2 MSC純度表型鑒定(免疫組化，×100)

2.3流式細胞儀鑒定MSC的表型 細胞傳代至第五代時，流式細胞儀檢測 CD29表達率為(96.9±2.5)%，CD44表達率為(78.1±1.9)%，再次提示所檢測細胞是非造血干細胞MSC而不是其他白細胞、成纖維細胞等。

3 討 論

干細胞是指那些具有自我復制能力，并可以經(jīng)過不可逆的終末分化過程產生子代細胞的細胞，對未來的組織器官修復和替代具有極其重要的作用和深遠的影響〔7,8〕。骨髓MSC的特點在于取材方便，體外擴增力強，能定向分化，易于從自體獲得，不會發(fā)生免疫排斥反應，體外基因轉染率高〔9,10〕。目前用于分離MSCs的方法有多種，如密度梯度離心法(Percoll和Ficoll)、貼壁篩選法、流式細胞儀法等〔11,12〕。較為常用的是密度梯度離心法，而Percoll又為首選，但其關鍵在于分離前的細胞處理和分離后的細胞吸取。本實驗驗證了吸取粉白色絮狀沉淀層為最佳吸取層，區(qū)別于以往吸取白色單個核細胞層；另外在離心轉速及時間上的選擇也為最佳，與MSCs純度有關。培養(yǎng)MSC的關鍵是鑒定其純度，采用免疫組織化學技術簡便、靈敏度高，實驗結果可以直接觀察。目前非造血干細胞MSC因其表達多種表面抗原，但可以鑒定其特異性的重要標記抗原僅有CD29+、CD44+，CD34-、CD45-又是造血干細胞重要標記抗原，因此采用免疫細胞化學方法和流式細胞儀應用特異性抗體結果鑒定MSC，CD29、CD44免疫細胞化學染色呈陽性反應(棕黃色)，CD34、CD45、膠原蛋白Ⅱ染色呈陰性反應，說明了培養(yǎng)的細胞是非造血干細胞MSC，而不是造血干細胞、內皮細胞、白細胞及成纖維細胞(CD29+、CD44+、CD34-、CD45-)；膠原蛋白Ⅱ軟骨細胞的特異性標志物染色陰性，亦說明所培養(yǎng)的細胞還未向軟骨細胞分化〔13～15〕。這一培養(yǎng)方法的改良提高了MSC的純度及培養(yǎng)成功率，為其他醫(yī)學研究奠定了實驗基礎。