普蘭林肽改善阿爾茨海默病的機制

連勇軍 鄒良玉 歐藝 趙亞麗

(1深圳市人民醫院神經內科，廣東 深圳 518020；2深圳市福永人民醫院內二科)

研究表明，2型糖尿病患者發展為阿爾茨海默病(AD)的風險顯著增加〔1〕，AD患者中包括胰島素在內的多種代謝激素水平有明顯變化，比如皮質醇和瘦素〔2～6〕。用胰島素或相關的代謝激素恢復腦部胰島素信號傳導可能為AD患者提供益處。胰島淀粉樣多肽能通過血腦屏障，小鼠中胰島淀粉樣多肽的腦攝取量約為胰島素的3倍，其受體廣泛分布在整個中樞神經系統(CNS)中，在大腦最后區，孤束核，臂旁核，杏仁核，下丘腦，伏隔核和背側切片中有最高密度的胰島淀粉樣多肽結合〔7〕。胰島淀粉樣多肽具有抗焦慮和抗抑郁〔8〕的作用及鎮痛特性〔9〕，但是這些作用機制尚未完全了解。在外周組織和CNS中，胰島淀粉樣多肽與胰島素信號級聯相互作用，激活胰島素的下游靶標，比如信號轉導和轉錄激活因子(STAT)3，腺苷一磷酸(AMP)激活蛋白激酶(AMPK)和蛋白激酶B(Akt)級聯，參與細胞代謝和存活〔10〕。除了胰島素信號通路之外，胰島淀粉樣多肽也是細胞外調節蛋白激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的調節器，這與海馬體的突觸可塑性和記憶鞏固密切相關〔11，12〕。本研究探討胰島淀粉樣多肽類似物普蘭林肽對SAMP8小鼠的記憶效應，通過分析體內外的信號轉導變化，驗證受體功能，確定與改善認知相關的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 醋酸普蘭林肽購自Sigma公司；細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)5，p35/p25蛋白，突觸蛋白(Synapsin)Ⅰ，血紅素加氧酶(HO)-1，磷酸化(p)-ERK1/2和ERK1/2抗體購自CST公司；二抗購自北京中杉金橋生物有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒及電化學發光液購自上海碧云天生物公司；滲透性泵購自Alzet公司；神經基礎培養基(Neurobasal-A)、B27購自美國Gibco公司。

1.2實驗動物 6月齡SAMP8小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心。集體飼養于SPF級環境中，給予晝夜各12 h的光線變化，正常溫控，自由飲水攝食。SAMP8小鼠隨機分為普蘭林肽組或生理鹽水組，每組10只，實驗周期共5 w。將Alzet微型滲透壓泵手術植入實驗小鼠皮下，每天輸注0.25 mg/kg醋酸普蘭林肽(0.6 mg/ml)或生理鹽水，速度為0.5 ml/h。整個實驗過程每2 w換1次新的填充泵。所有動物每周稱重。

1.3物體識別實驗 在5 w實驗期的最后1 w，進行物體識別實驗，檢測動物行為。測試設置包括4個相鄰的開放式箱子，間接昏暗照明。在訓練前1天，將小鼠單獨置于1個箱子中，適應15 min。第2天，在箱子底部一側相對放入2個相同物體，將小鼠背對物體放入箱子中，允許小鼠探索環境10 min，在此期間，開啟錄像設備，用跟蹤系統記錄其運動軌跡。每次試驗后，用70%乙醇清洗物體和開放箱子以消除任何嗅覺影響。3 h后進行測試試驗。小鼠再次被放置在箱子中，但是，一個類似大小和復雜性的新物體取代了訓練期間兩個相同物體中的一個。允許小鼠探索環境5 min，然后將其放回籠中。記錄訓練和測試期間小鼠探索物體的時間，即距離物體2 cm范圍內的持續時間。辨別指數計算公式為：(N-F/N+F)，N表示動物探索新物體的時間，F表示動物探索熟悉物體的時間。

1.4Western印跡實驗 物體識別實驗結束后，處死小鼠，解剖取出大腦組織，分離海馬體。在加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿，離心，取上清，用BCA試劑盒對蛋白定量。在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中進行分離，將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%牛奶中封閉1 h后，將膜置于稀釋的抗體中，在4℃下孵育過夜，隨后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h，通過電化學發光法顯色，分析目的條帶光密度值。主要檢測Cdk5，p35，p25，Synapsin I，HO-1，p-ERK1/2和總ERK1/2表達量，選用β-actin作為內參蛋白。

1.5免疫組化實驗 取12只小鼠隨機分成兩組：普蘭林肽組和生理鹽水組，連續給藥2 w后處死。 解剖小鼠，取出大腦組織，用4%多聚甲醛固定24 h，然后置于30%蔗糖溶液(4℃)中3 d，切成40 μm的矢狀切片，貼片。清洗后，在1%的過氧化氫溶液中孵育1 h，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，用3%牛血清白蛋白(BSA)+0.5%Triton封閉1 h，加入稀釋的人中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)抗體和環氧化物酶(COX)-2抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，然后二抗溫育2 h。使用親和素-生物素-過氧化生物酶復合物(ABC)試劑和二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑盒完成染色，顯微鏡下觀察。

1.6大鼠大腦皮質神經元的原代培養 從孕18 d SD大鼠胚胎中分離出大腦皮質，剪碎，胰蛋白酶消化，并制成單細胞懸液。將神經元細胞接種到6孔板，置于含2%B27的神經基礎培養基(Neurobasal-A)中，在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養6 d，加入不同濃度的普蘭林肽平行處理1 h或3 h，然后將細胞裂解，離心收集上清，并進行蛋白免疫印跡試驗。

1.7統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1普蘭林肽處理改善SAMP8小鼠物體識別的記憶功能 與探索熟悉物體所需時間相比，在探索新穎物體時，普蘭林肽組花費更長的時間，而生理鹽水組小鼠探索新穎物體和熟悉物體花費的時間沒有太大區別。兩組辨別指數比較差異有統計學意義〔(0.68±0.02)vs(0.49±0.04),P<0.05〕。

2.2普蘭林肽降低SAMP8小鼠海馬體中炎癥標志物的表達量 與生理鹽水組(0.21±0.03)相比，普蘭林肽處理組HO-1蛋白表達量顯著降低(0.17±0.01,P<0.05)，普蘭林肽組小鼠海馬體中COX-2表達較生理鹽水組顯著降低〔(2.9±0.3)vs(5.0±0.3),P<0.05〕;兩組小鼠海馬體中HNE水平差異無統計學意義〔(2.5±0.4)vs(3.7±0.5),P>0.05〕，見圖1，圖2 。

圖2 兩組COX-2和HNE表達(×400)

2.3普蘭林肽增加SAMP8小鼠海馬體中SynapsinⅠ表達 與生理鹽水組(0.86±0.12)比較，普蘭林肽組海馬體中SynapsinⅠ表達顯著增加(1.17±0.15，P<0.01)。見圖3。與生理鹽水組(0.58±0.08)比較，普蘭林肽組Cdk5表達顯著增加(0.85±0.11，P<0.01)。生理鹽水組與普蘭林肽組比較p35(0.23±0.05 vs 0.31±0.04)、p25(0.67±0.07 vs 0.83±0.06)表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 Western印跡檢測SynapsinⅠ蛋白表達

圖4 Western印跡檢測Cdk5、p25、p35蛋白表達

2.4普蘭林肽增加小鼠大腦皮質原代神經元細胞中Cdk5的表達 不同濃度的普蘭林肽孵育細胞1 h和3 h后，顯著增加了神經元中Cdk5的表達，且呈劑量依賴性(P<0.05)。普蘭林肽作用3 h增加了p-ERK1/2的表達。見表1、圖5。

表1 不同濃度普蘭林肽對小鼠大腦皮質原代神經元細胞中Cdk5及p-ERK1/2表達的影響

與0 nmol/L比較：1)P<0.05

圖5 不同濃度普蘭林肽對小鼠大腦皮質原代神經元細胞中Cdk5和p-ERK1/2表達的影響

3 討 論

在AD患者血漿樣本中，低胰島淀粉樣多肽水平與AD存在顯著關聯〔11〕。本研究結果表明：在物體識別實驗中，普蘭林肽作用改善了小鼠的認知、學習和記憶過程。遇到熟悉或新奇物體的探究能力，并不是一般的活動變化，是與認知相關的，并且取決于內側顳葉功能的完整性〔13〕，內側顳葉是一個受早期和晚期AD影響的區域。所以，這些發現顯示普蘭林肽可能有益于治療散發型AD患者。

長期給予普蘭林肽能夠改善AD的重要病理特征，包括突觸損害和氧化應激。在AD的發病機制中，炎癥反應和突觸損害兩種病理過程均存在于SAMP8小鼠的海馬組織中。本實驗結果表明，在SAMP8小鼠中，普蘭林肽處理組顯著降低了HO-1的表達。HO-1是一種在氧化應激和炎癥反應期間被激活的細胞應激蛋白，在AD患者的大腦皮層和海馬體中表達增加，并且在SAMP8小鼠中呈年齡依賴性增加〔14〕。進一步實驗顯示，普蘭林肽降低了海馬體中脂質過氧化反應產物HNE的含量，HNE是一種已知的AD大腦中早期大量存在的細胞應激標記物。COX-2在老齡化和AD大腦中逐漸增加的經典炎癥標志物，其表達量明顯降低。

海馬體中SynapsinⅠ是一種位于神經元突觸小泡中的蛋白質，其與突觸的形成，神經遞質釋放，學習和記憶密切相關〔15〕。普蘭林肽處理的SAMP8小鼠中SynapsinⅠ表達的增加，說明普蘭林肽對突觸有保護作用或誘導突觸發生。Cdk5是一種脯氨酸導向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與新皮質發育過程中的樹突生長和神經細胞遷移〔16〕，同時在成人大腦的突觸可塑性，學習和記憶中也發揮重要作用。在普蘭林肽處理的大腦皮質原代神經元細胞中，Cdk5的表達呈劑量依賴型，說明大腦海馬體和皮層神經元中Cdk5的強勁增長可能是普蘭林肽發揮作用的分子機制。Cdk5與突觸小泡循環，神經遞質合成，軸突運輸，神經元的存活和細胞死亡及海馬神經再生密切相關。已有研究表明，Cdk5在突觸形成中起重要作用〔17〕，很可能是由于它對SynapsinⅠ的下游效應。 雖然Cdk5被認為具有神經保護作用，但分裂產物p25的積累，導致Cdk5失調，引起Tau蛋白和神經元過度磷酸化〔18〕。

本研究中，普蘭林肽對p25或p35的表達并沒有顯著影響，表明普蘭林肽可以選擇性地增加Cdk5的表達，而不促進該激酶的失調。下一步的研究需要確定普蘭林肽對Tau蛋白磷酸化的影響，并確定Cdk5是否是影響突觸可塑性標志物如SynapsinⅠ變化的因素。

綜上，胰島淀粉樣類似物普蘭林肽能夠改善散發型AD小鼠模型的認知缺陷，減少炎癥反應和氧化應激標志物，增加海馬組織Synapsin的表達，并與Cdk5的表達有密切關系，這為AD的研究和治療提供新思路、新途徑。