丁苯酞對老年兔心搏驟停復蘇后的影響

楊虹 成靜 陳芳 高貽鈞 盧軍 王凌

(1武漢市第四醫院 華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院急診科，湖北 武漢 430034；2華中農業大學)

心搏驟停(CA)是世界范圍內主要急診死亡原因之一，每年有超過45萬人發生CA〔1〕。隨著心肺復蘇(CPR)術逐步得到推廣和普及，患者經復蘇后自主循環恢復(ROSC)得到提高，但存活率依然很低〔2〕。CA后ROSC主要的病理生理變化是缺血再灌注損傷，造成全身炎癥反應及凝血功能障礙，進一步形成多器官損傷〔3～5〕，特別是腦損傷。丁苯酞(NBP)有抗炎、抗氧化應激、抗細胞凋亡、抑制心肌細胞肥大、對心臟內皮細胞保護等廣泛藥理作用〔6〕，對急性腦缺血具有明顯的治療作用〔7，8〕，并已證明在一定程度上可減輕多器官損傷〔9〕。本研究欲探討NBP對老年兔CA復蘇后多器官的保護作用。

1 材料與儀器

1.1實驗動物 選用30月齡體重為3.0～3.5 kg的清潔級健康家兔48只，性別不限，購于湖北逸摯誠生物科技有限公司，實驗動物使用許可證SYXK(鄂)2016-0088。動物置于(25±1)℃，相對濕度為(50±10)%，白天黑夜各12 h的清潔級環境中適應性喂養1 w，自由進食、飲水。

1.2主要試劑與實驗儀器 NBP(石藥集團恩必普藥業有限公司，國藥準字H20100041，規格100 ml∶25 mg)，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、血清神經元特異性烯醇化酶(NSE)、S-100B酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D公司)，DXC-800全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，致顫儀及動物胸外按壓設備(由華中農業大學輔助研發，動物胸外按壓設備申請專利號：201820076129.4)，SAR-830A小動物呼吸機(美國CWE公司)，mindray BeneHeartD3除顫儀監護儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)，一次性氣管插管導管及配套導絲(河南駝人醫療器械集團有限公司)。

1.3動物準備 所有實驗動物耳緣靜脈穿刺置入24G Y型靜脈留置針，置管成功后注射3%戊巴比妥30 mg/kg予以麻醉。麻醉成功后將動物固定后行胸腹部備皮，連接三通開關，一端連接含有肝素(5 IU/ml)抗凝的生理鹽水輸液器，防止血液凝固，另一端經換能器與心電監護儀相連。將2.5號氣管插管導管自兔口角緩慢置入，導管遠端到門齒的距離為11～12 cm。手術操作完成并穩定后，記錄肛溫(T)、心率(HR)、呼吸頻率(RR)、平均動脈壓(MAP)、等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(dp/dtmax)、等容舒張期左心室內壓力下降的最大速率(-dp/dtmax)。

1.4動物模型建立 將欲建模動物置入2個電極，一個置入皮下(位于心搏最強點)，另一個置于食管內，應用致顫儀持續交流電(10 V，4 mA，2 min)經食管致顫。致顫成功的判斷標準：①電刺激后動脈收縮壓逐漸下降至25 mmHg以下；②血壓監測的動脈搏動波形消失；③停止電刺激后心電監護示心電圖波形為室顫。致顫成功后無處理心室顫動6 min后，開始應用動物胸外按壓設備進行機械胸外按壓，按壓部位為胸骨體正中，頻率為200次/min，按壓深度為胸廓前后徑的1/3，按壓/放松比為1/1，并同步機械通氣，盡早給予雙向波經胸體外除顫。機械通氣接小型動物呼吸機。呼吸機初始參數設定頻率為45次/min，潮氣量10 ml/kg。開始CPR的即刻耳緣靜脈注射腎上腺素0.15 mg/kg，必要時每間隔3 min重復應用。待除顫儀準備完全后若為室顫，則予非同步雙相波10 J除顫，若不能轉復為自主心律則再繼續按壓2 min后再次予10 J除顫，直至ROSC。當恢復竇性HR及MAP>40 mmHg并至少持續1 min以上視為復蘇成功。動物經上述程序搶救30 min自主循環未能恢復者為復蘇失敗，對復蘇失敗者移除所在組別。對ROSC的動物進行心電和血流動力學監測，自主呼吸微弱者進行機械通氣，自主呼吸恢復后拔除所有導管，放回籠中飼養，對于不能自主飲水、進食的動物，在ROSC后每12 h經耳緣靜脈緩慢補充5%葡萄糖氯化鈉溶液20 ml/kg，觀察終點為72 h。

1.5實驗分組 實驗分為①CA復蘇(CA)組(n=24)，將動物麻醉后，行氣管插管，心電監護，有創血壓監測，并致顫及CPR建模，建模及復蘇成功后觀察至72 h；②NBP干預(NBP)組(n=24)，將動物麻醉后，行氣管插管，心電監護，有創血壓監測，并致顫及CPR建模成功后立即耳緣靜脈注射NBP 5 ml/d。建模及復蘇成功并注射藥物后觀察至72 h。

1.6標本的采集檢測和神經功能學評分 CA組及NBP組完成預設處理后，分別于CA前、ROSC后12 h、24 h、72 h采血和進行神經功能評分。血清NSE、S-100B的水平按ELISA試劑盒說明進行檢測。血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(cTn)I的水平用全自動生化分析儀檢測。神經功能評分由2名非本實驗組成員，參照Jia等〔9〕神經功能學評分(NDS)方法，從意識、基本反射、運動、行為等方面對存活兔在ROSC后各時間點進行神經功能評定，總分0～80分，評分越低，代表腦神經功能越差。0分為腦死亡，80分為正常。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0進行重復測量方差分析。

2 結 果

2.1兩組基礎參數和誘導室顫情況 在誘導室顫前，兩組兔的體重、HR、血流動力學參數比較差異無統計學意義(均P>0.05)。 見表1。

本實驗中的48只家兔全部誘發室顫成功。在電刺激開始后，動脈血壓迅速下降到25 mmHg以下，搏動波形消失。電刺激結束時室顫發生率為100%(48/48)，無無脈性電活動及CA發生。4例室顫轉為無脈性電活動，在CPR開始時心電圖表現為室顫的比例為87.5%(42/48)，無脈性電活動比例為12.5%(6/48)。

2.2兩組腦損傷指標變化及NDS評分比較 CA組ROSC后12 h、24 h、72 h血清NSE、S-100B的水平顯著高于CA前，NDS評分顯著低于CA前(P<0.05)。NBP組ROSC后12 h、24 h、72 h NSE、S-100B均比CA組同時間點明顯降低,NDS評分比CA組同時間點明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.3兩組器官損傷指標變化比較 CA組ROSC后12 h、24 h、72 h血清Cr、BUN、ALT、AST、cTnI的水平顯著高于CA前，差異有統計學意義(P<0.05)。CA組ROSC后12 h、24 h血清CK-MB的水平顯著高于CA前，差異有統計學意義(P<0.05)，而ROSC后72 h血清CK-MB的水平與CA前比較差異無統計學意義(P>0.05)。NBP組ROSC后12 h、24 h、72 h血清Cr、BUN、ALT、AST的水平均顯著低于同時間點CA組，差異有統計學意義(P<0.05)。NBP組ROSC后12 h、24 h血清CK-MB、cTnI水平比同時間點CA組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而NBP組ROSC后72 h血清CK-MB、cTnI水平與同時間點CA組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別體重(kg)體溫(℃)HR(次/min)MAP(mmHg)RR(次/min)dp/dtmax-dp/dtmaxCA組2.17±0.7238.53±0.35238±1090±937±45 156±712-3 373±378NBP組2.07±0.6838.24±0.32235±1192±738±65 097±702-3 385±348

指標組別CA前ROSC后12 hROSC后24 hROSC后72 hNSE(pg/ml)CA組7.28±0.9522.01±2.211)32.33±1.941)19.67±1.881)NBP組8.35±1.1018.65±0.982)21.68±1.522)14.02±1.622)S-100B(pg/ml)CA 組7.23±2.0217.11±3.681)12.66±2.431)8.24±1.861)NBP組8.66±1.9212.03±1.692)8.63±2.132)7.18±1.622)NDS(分)CA組80.0±0.053.8±3.91)56.8±3.81)68.2±2.51)NBP組80.0±0.065.6±3.52)68.5±4.02)75.3±2.22)

與CA前比較：1)P<0.05；與同時間點CA組比較：2)P<0.05；下表同

不同時間點組別Cr(μmol/L)BUN(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)CK-MB(U/L)cTnI(μg/L)CA前CA組53.17±4.726.74±1.9343.23±4.2637.92±2.06486.43±39.814.75±0.82NBP組54.68±5.126.57±1.7644.32±4.4739.25±2.54493.68±55.844.54±0.75ROSC 12 h CA組117.28±6.231)13.53±2.821)68.14±5.651)55.64±3.421)722.35±203.121)27.34±2.681)NBP組85.74±3.432)8.67±2.142)51.42±4.152)43.16±3.622)556.63±54.182)13.02±2.472)ROSC 24 h CA組133.42±3.321)22.34±1.691)92.74±4.211)75.43±4.011)2 353.67±443.671)42.05±3.291)NBP組112.39±2.962)14.95±0.992)72.01±3.932)56.46±4.362)1 569.47±113.662)31.05±3.652)ROSC 72 h CA組156.08±4.121)28.65±3.181)186.24±3.651)152.20±3.851)519.88±57.1516.65±2.131)NBP組133.28±4.352)20.45±1.962)150.16±5.552)120.13±3.482)505.50±59.2410.08±1.80

3 討 論

NBP是人工合成的左旋芹菜甲素的消旋體，是臨床用于急性缺血性腦卒中的常用藥物〔7,8〕。心臟驟停4～6 min后便可發生神經元不可逆的損傷〔10〕，Zhang等〔11〕研究發現用NBP治療大鼠心搏驟停時能有效提高海馬CA1區神經元的存活率，它的潛在治療機制包括內皮細胞免受氧化應激、線粒體損傷和隨后的細胞死亡、增加血管內皮細胞生長因子和缺氧誘導因子(HIF)-1α的表達、改善腦微血管、抑制炎癥反應、維持神經元的結構和形態，促進神經功能恢復〔7，8〕，本研究通過比較CA組和NBP組兩組兔在心搏驟停后不同時間點的NDS評分，也支持上述觀點。NSE和S100B是多種疾病腦損傷的指標，可用于準確地評估CPR后患者的腦損傷嚴重程度〔12～14〕。本實驗中CA組血清中NSE、S-100B的水平顯著增高，NSE于復蘇后24 h達高峰，而S-100B于復蘇后12 h達高峰。而在NBP組中，復蘇后各時間點上述指標水平顯著低于CA組，提示NBP對兔心搏驟停后的腦損傷有治療作用。

缺血/再灌注損傷廣泛存在于心搏驟停自主循環恢復后心、腦、肝、腎、胃腸道等器官，發病過程涉及多個凋亡相關基因〔15，16〕。NBP對凋亡途徑中關鍵的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3 蛋白發揮抑制作用，同時NBP還可能通過降低花生四烯酸含量，提高腦血管內皮 PGI2 的水平，抑制谷氨酸釋放，降低細胞內鈣濃度，抑制自由基和提高抗氧化酶活性，進而阻斷多個缺血/再灌注病理環節，進而達到保護細胞的目的。Wang等〔17〕研究結果表明兔經心搏驟停復蘇后，血清Cr、ALT水平隨復蘇后時間的推移逐步升高，復蘇后72 h達頂峰，與本實驗中Cr、ALT增長趨勢一致。本研究結果顯示，兔心搏驟停復蘇后血清Cr、BUN、ALT、AST的水平隨復蘇后時間的推移逐步升高，在本研究設置的觀察點中，復蘇后72 h的水平最高。但并不能因此認為復蘇后72 h是頂峰值，可能在72 h之后的時間里出現頂峰值，而在本研究中因時間點的有限并不能觀察到。本研究中，兔心搏驟停經復蘇后血清CK-MB水平于24 h達高峰，72 h與CA前無統計學差異，cTnI水平于24 h達峰值，72 h仍未恢復正常，此兩者變化趨勢與人體無異。NBP干預組，血清Cr、BUN、ALT、AST水平在復蘇后12 h、24 h、72 h較之CA組顯著降低，血清CK-MB、cTnI水平在復蘇后12 h、24 h較CA組顯著降低，與Wang 等〔17〕報道大鼠心肌梗死模型NBP 改善心臟血流動力學功能和減少心臟梗死面積的結果較為一致。因此，推斷NBP能夠改善心搏驟停復蘇后家兔肝腎心的損傷。

本研究受到NBP治療腦梗死取得良好效果的啟發，在兔心搏驟停復蘇模型的基礎上，應用NBP對其進行干預，結果顯示，預防應用NBP對復蘇后腦、心、肝、腎等多器官損傷具有一定保護作用，可能是一種潛在的治療心搏驟停和復蘇的策略。其可能的機制包括提高缺血區血流量; 抗氧化減少細胞凋亡; 改善線粒體腫脹和空泡化〔18〕。雖然本研究的思路是創新性的，但僅抽取血液指標和NDS評分來評估NBP對心搏驟停復蘇后家兔的影響，其行為功能、器官組織形態是否有所改善，需進一步研究。