姜黃素通過PI3K/AKT通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導高血壓中血管膠原重構

居來提·艾買提 阿布都沙拉木·阿布都熱衣木 熱孜萬古麗·吐爾汗

(新疆醫科大學附屬中醫醫院 1干部二科，新疆 烏魯木齊 830000；2老年病科)

血管重構是高血壓最為關鍵的病理變化，研究證明，高血壓患者的血管重構幾乎影響所有組織器官，高血壓血管重構一般為血管膠原重構〔1,2〕。機體血管膠原重構是血管對刺激的復雜的動態反應過程，最終使血管產生膠原結構和數量變化〔3〕。研究證實姜黃素具有十分理想的心血管保護作用〔4〕。能顯著抑制膠原合成相關細胞的功能，大幅度控制膠原含量〔5〕。高血壓血管內皮細胞自噬水平紊亂與膠原水平存在相關性〔6〕。本研究觀察姜黃素對血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓模型小鼠血管膠原重構的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采用野生型C57BL/6小鼠，共40只，雄性，鼠齡8 w，體重18～22 g。小鼠均置于有溫控(20～25℃)清潔通風的動物房中飼養。所有小鼠取材前禁食12 h，自由進水。

1.2實驗試劑 姜黃素、血管緊張素Ⅱ購自美國Sigma公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、西羅莫司靶蛋白(mTOR)、Bax、Bcl-2及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體購自美國Abcam公司。磷酸化(p)-PI3K、p-AKT及p-mTOR抗體購自美國BD公司。

1.3實驗分組 小鼠隨機分為4組，每組10只。對照組接受磷酸鹽緩沖液(PBS)微量泵注(劑量同血管緊張素Ⅱ組)；血管緊張素Ⅱ組接受血管緊張素Ⅱ微量泵注〔1 500 ng/(min·kg)，7 d〕建立高血壓模型〔7〕；姜黃素組接受姜黃素腹腔注射干預〔200 mg/(kg·d)，7 d〕〔6〕;雙干預組接受血管緊張素Ⅱ微量泵注〔1 500 ng/(min·kg)，7 d〕+姜黃素腹腔注射干預〔200 mg/(kg·d)，7 d〕。

1.4血管緊張素Ⅱ誘導高血壓模型 按照18～22 g體重小鼠灌泵7 d計算，微量泵釋放血管緊張素Ⅱ的速率為1 500 ng/(min·kg)，每只微量泵可容納90 μl的血管緊張素Ⅱ，計算出血管緊張素Ⅱ的濃度(288～320 μg/L)。使用異氟烷氣體麻醉小鼠，用干凈的眼科剪剪開小鼠背部皮膚約2 mm小口，緩慢地將灌好血管緊張素Ⅱ和PBS的微量泵埋入小鼠皮下，使用眼科線縫合傷口。血管緊張素Ⅱ灌注術后第4天開始監測小鼠血壓，直到術后第7天，以確定血管緊張素Ⅱ灌注成功。術后第7天取材。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 取小鼠主動脈進行石蠟切片，脫蠟至水干；蘇木素染色2 min；使用PBS沖洗浮色；0.5%鹽酸酒精分化，自來水沖洗。伊紅染色1 min，使用PBS沖洗浮色；乙醇梯度脫水；石蠟切片固定。中性樹膠封片，顯微鏡下照片。HE染色后采用BI2000醫學圖像分析系統，40倍顯微鏡下測定各組小鼠胸主動脈中膜厚度(MT)、管腔內徑(LD)，按順時針方向測12個平均值，并計算MT/LD。

1.6Masson染色方法 取小鼠主動脈進行石蠟切片，脫蠟至水干；5%天青石蘭染色5 min，使用PBS沖洗浮色。蘇木素染色3 min，使用PBS沖洗浮色。使用麗春紅∶酸性品紅=1∶2，染色20 min；1%光綠染色4 min；乙醇梯度脫水；石蠟切片固定。中性樹膠封片，顯微鏡下照片。石蠟切片進行Masson染色，采用BI2000醫學圖像分析系統。

1.7Western印跡 取部分主動脈血管組織，加入裂解液，2 h后加入稀釋過的相應抗體(1∶500)，在4℃下過夜；然后加入二抗并在室溫下孵育1 h，加入發光底物，通過Gene Box成像系統進行曝光，并記錄反應條帶的數目，用Quantity One軟件分析同一樣本中蛋白與內參甘油醚-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白條帶的灰度值之比。

1.8統計學分析 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組血壓及膠原含量比較 與對照組相比，血管緊張素Ⅱ組血壓顯著升高(P<0.05)。雙干預組血壓增幅較低，高血壓進展慢于血管緊張素Ⅱ組。姜黃素組血壓與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，血管緊張素Ⅱ組主動脈膠原含量顯著增加(P<0.05)。與血管緊張素Ⅱ組相比，雙干預組主動脈膠原含量顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組主動脈Masson染色(×40)

組別收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)膠原纖維含量對照組99.0±5.070.0±6.013.1±2.2血管緊張素Ⅱ組123.0±9.01)87.0±8.01)32.5±6.51)姜黃素組95.0±6.02)67.0±5.02)19.6±6.72)雙干預組111.0±12.01)2)89.0±7.01)15.8±3.22)

與對照組比較：1)P<0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組主動脈MT、LD及MT/LD比值比較 與對照組相比，血管緊張素Ⅱ組MT、LD及MT/LD比值顯著升高(P<0.05)。與血管緊張素Ⅱ組比較雙干預組MT、LD及MT/LD比值顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

2.3各組自噬相關蛋白磷酸化水平比較 雙干預組PI3K、AKT及mTOR表達含量與血管緊張素Ⅱ組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，p-PI3K、p-AKT及p-mTOR表達顯著低于血管緊張素Ⅱ組(P<0.05)。見表3、圖3。

2.4姜黃素影響血管自噬終末事件 與對照組比較，血管緊張素Ⅱ Bcl-2含量顯著增加(P<0.05)，Bax和Cleaved Caspase-3的含量顯著降低(P<0.05)；與血管緊張素Ⅱ組比較，雙干預組顯著增加Bax和Cleaved Caspase-3的含量(P<0.05)，顯著減少Bcl-2含量(P<0.05)。見表3、圖4。

表2 各組主動脈MT、LD及MT/LD比較

圖2 各組主動脈染色(HE，×40)

組別PI3KAKTmTORp-PI3Kp-AKTp-mTORBcl-2BaxCleaved Caspase-3對照組1.6±0.61.3±0.51.2±0.40.9±0.40.5±0.20.4±0.20.6±0.21.2±0.41.4±0.3血管緊張素Ⅱ組1.5±0.81.2±0.41.1±0.31.4±0.51)1.1±0.31)0.9±0.31)1.2±0.51)0.2±0.11)0.2±0.11)姜黃素組1.7±0.51.4±0.31.3±0.51.1±0.42)0.7±0.32)0.1±0.12)0.8±0.32)0.7±0.32)1.1±0.32)雙干預組1.6±0.71.3±0.41.2±0.20.8±0.22)0.6±0.22)0.3±0.22)0.7±0.12)1.1±0.52)1.2±0.42)

圖3 各組Western印跡法檢測各組自噬相關蛋白磷酸化水平

圖4 Western印跡檢測各組主動脈Bax、Cleaved Caspase-3及Bcl-2蛋白

3 討 論

本研究證實姜黃素能夠顯著降低高血壓病程中的血管膠原重構水平，姜黃素干預改善了包括血管內徑及膠原含量在內的多項高血壓血管重構等相關指標，且姜黃素能夠通過調控PI3K/AKT相關自噬通路減緩高血壓血管膠原病變。

研究提示，姜黃素低劑量生活干預能夠調控患者晝夜血壓節律，輕度降低血壓及減少高血壓風險〔7,8〕。姜黃素能夠顯著縮小高血壓所致的血管管徑病變。研究雖然提示姜黃素能夠保護血管系統的穩定性，但多數研究局限于內皮功能，本研究補充了姜黃素對于血管整體穩定性的作用，這對于高血壓治療十分重要〔9,10〕。

主動脈內皮細胞自噬水平異常會直接導致內皮功能紊亂，進而加劇高血壓病變程度，而靶向敲除自噬相關基因能夠有效穩定血壓〔11,12〕。研究報道自噬通路分子的低磷酸化可顯著抑制膠原合成〔13〕。本研究發現姜黃素不能影響PI3K、AKT、mTOR等非磷酸化蛋白表達，導致該現象的可能原因有：姜黃素劑量不足；高血壓模型建立后干預時間較短(7 d)。因此，我們對自噬下游事件的分子標志物進行了驗證，并發現姜黃素可增加Bax和Cleaved Caspase-3的含量，并減少Bcl-2的含量，從而證實了：盡管中等劑量姜黃素干預僅影響高血壓病變血管的自噬磷酸化水平，但已經足夠影響自噬終末事件，從而最終改善血供膠原重構水平。

綜上，姜黃素具有高血壓防治潛力，能夠通過調控PI3K/AKT自噬通路的磷酸化水平改善高血壓病變血管的膠原重構水平。