甲狀腺濾泡癌中Beclin-1和熱休克轉錄因子1表達及其與臨床病理參數的關系

藺廣榮 劉克毅 李紀男 姜恒 柴芳

(錦州醫科大學附屬第一醫院甲狀腺外科，遼寧 錦州 121001)

甲狀腺濾泡癌(FTC)是甲狀腺癌中第二種常見惡性腫瘤。根據侵襲程度分為兩類〔1〕：廣泛侵入型FTC(WIFTC)和微小侵入型FTC(MIFTC)，前者對鄰近的組織和(或)血管有廣泛的浸潤，而后者局限于包膜和(或)血管侵犯，兩者預后差異明顯。Beclin-1屬于自噬相關蛋白，對細胞的自噬過程起著重要的調控作用。熱休克轉錄因子(HSF)1是調控熱休克蛋白(HSP)表達的重要因子，備受癌癥研究者關注〔2〕。本研究通過檢測Beclin-1和HSF-1蛋白在FTC及癌旁組織的表達水平，探討兩者與FTC臨床病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2004年1月至2017年12月錦州醫科大學附屬第一醫院行手術治療確診為FTC的患者53例，男17例，女36例，年齡22～72歲，平均(49.5±20.1)歲。將標本距癌旁≤2 cm的癌旁組織作正常對照。納入標準：①病理診斷均有兩位年資高的病理專家共同確診；②無甲狀腺癌家族遺傳史；③術前均未行內分泌治療及放化療；④無合并橋本氏病等甲狀腺相關疾病；⑤臨床分期按照2010年美國癌癥聯合會(AJCC)分期。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。

1.2試劑與方法 兔抗人Beclin-1(WL02237，Wanleibio，中國)、兔抗人HSF-1(WL01645，Wanleibio，中國)、生物素化山羊抗兔IgG(A0277，Beyotime，中國)、辣根酶標記鏈酶親合素(A0303，Beyotime，中國)、DAB顯色液(DA1010，Solarbio，中國)。免疫組化采用SABC免疫組織化學法。組織經10%甲醛固定后脫水、包埋，切片厚度4 μm，用于免疫組化檢測Beclin-1、HSF-1蛋白表達。一抗均按1∶150稀釋，按試劑盒說明書操作，3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶，微波修復。依次加入一抗及二抗，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，中性樹膠封片。磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗作為陰性對照。

1.3結果判斷 本次實驗染色結果由兩位經驗豐富的病理科醫生雙盲法獨立閱片。根據染色強度和陽性細胞百分比來評分。以出現棕黃色顆粒沉淀為陽性表達。強度評分為0分(無染色)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)和3分(棕褐色)。比例積分為0(<5%陽性細胞)、1(5%～24%陽性細胞)、2(25%～49%陽性細胞)、3(50%～74%陽性細胞)和4(≥75%陽性細胞)。強度評分和比例積分相乘產生了最終的染色評分：-(0分)、+(1～4分)、(5～8分)和(9～12分)。在統計學分析中，-或+最后染色評分被合并到陰性表達，或最后評分被合并到陽性表達。

1.4統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關分析，條件不足者用Fisher確切概率法。

2 結 果

2.1FTC中Beclin-1和HSF-1陽性表達 Beclin-1和HSF-1在FTC中呈棕黃色或棕褐色彌漫性強表達，而在癌旁正常甲狀腺組織不表達或局灶弱表達。見圖1。兩組Beclin-1和HSF-1陽性表達率差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

圖1 FTC、癌旁組織中 Beclin-1、HSF-1陽性表達(SABC法，×400)

2.2Beclin-1和HSF-1表達與FTC臨床病理參數間的關系 FTC中Beclin-1和HSF-1表達均與病理類型相關(P<0.001)，HSF-1表達與遠處轉移相關(P<0.05)。見表2。

表1 FTC、癌旁組織中Beclin-1和HSF-1蛋白的陽性表達〔n(%)，n=53〕

表2 FTC中Beclin-1和HSF-1表達與臨床特征的關系〔n(%)〕

2.3FTC中Beclin-1和HSF-1表達相關性 Beclin-1和HSF-1表達呈顯著正相關(r=0.419，P<0.01)。見表3。

表3 FTC中Beclin-1和HSF-1表達相關性分析(n)

3 討 論

FTC是起源于甲狀腺濾泡上皮的惡性腫瘤，易通過血運發生遠處轉移，淋巴轉移較少見。據統計，10%～15% FTC患者會通過血行轉移累及肺、肝、骨〔3〕，11%～39% FTC患者會復發〔4，5〕，很多患者失去了最佳手術時機。

自噬是溶酶體介導的細胞內分解代謝過程，細胞通過清除受損細胞器和長壽蛋白維持細胞內穩態。Beclin-1是自噬通路的重要調節器，能夠通過誘發腫瘤細胞自噬使腫瘤細胞持續增殖，在多種腫瘤中過度表達〔6～8〕。本研究發現，自噬相關蛋白Beclin-1在FTC中表達明顯高于癌旁組織，進而推測自噬參與了FTC的發生，這一點與既往研究一致〔9〕。本研究還提示自噬可能參與了FTC的發展。筆者推測腫瘤的生存狀態和自噬密切程度有關。隨著腫瘤侵襲力的增強，自噬可能會幫助腫瘤細胞擺脫應激環境來促進腫瘤的生長。盡管沒有發現Beclin-1的表達與遠處轉移存在相關，筆者考慮主要與納入的研究對象例數有關。研究表明Beclin-1表達缺失是甲狀腺乳頭狀癌形成過程的重要機制〔10，11〕。但是本研究發現，Beclin-1過度表達參與了FTC的發生與發展。筆者推測自噬在兩種類型的甲狀腺癌中發病的機制可能存在不同。Cha等〔12〕用免疫的方法檢測Beclin-1蛋白在FTC中的表達情況，結果均未表達，筆者認為可能與所選取的病例有關，Cha等〔12〕并未說明所選取病理類型及是否存在遠處轉移。

HSF-1是熱休克反應中最主要的調節因子，通過調控HSP的轉錄翻譯發揮生物學效應。目前已發現HSF-1在人類多種腫瘤中高表達，包括呼吸系統，泌尿系統，消化系統，生殖系統等，已成為多種癌癥治療的潛在靶點〔2〕。本研究結果說明HSF-1可作為FTC發生發展及侵襲轉移的關鍵性調控靶點。董麗濤〔13〕發現HSF-1的表達與子宮內膜癌分化程度、淋巴結轉移及浸潤的深度有關。Wu等〔14〕發現HSF-1的表達與腎癌的分期有關。而本研究發現HSF-1表達與FTC的病理類型及轉移有關。 Jin等〔15〕研究證實敲除HSF-1通過激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)活性可以減輕致癌物質對肝臟代謝的不利影響。另有研究證實，HSF-1敲除后，由于RNA結合蛋白人抗原R(HUR)的下調，通過HSF-1/HUR/缺鐵誘導因子(HIF)-1通路可以抑制乳腺癌細胞生長與遷徙〔16〕。最新研究發現，HSF-1可以通過調節HSP27的表達來調控MET/ERK信號通路中相關蛋白的表達，促進胃癌細胞增殖分化〔17〕。研究表明HSF-1既可以調控抑制依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)內外源性細胞凋亡通路，又可以促進Bcl-X(L)、Mcl-1和Bcl-2等抗凋亡蛋白的增加，抑制腫瘤細胞的凋亡并促進其增殖分化〔18〕。由此可見，HSF-1通過多種途徑參與了腫瘤的發生發展及侵襲轉移。HSF-1可以通過促進轉錄激活肝癌細胞中自噬相關蛋白ATG4B表達〔19〕。筆者推測，熱休克反應和自噬可能相輔相成共同參與了腫瘤的發生與發展。