椎管內神經鞘瘤中miR-17-92基因簇表達及意義

劉樹義 李瑜 劉盛澤 劉碧波 蘭凱 陳德平 從長春

(西安醫學院 1外科學教研室，陜西 西安 710021；2第二附屬醫院耳鼻咽喉科；3廈門大學附屬福州第二醫院神經外科)

椎管內神經鞘瘤(IS)是最常見的脊髓腫瘤。絕大多數腫瘤生長于脊髓外硬脊膜下，但也可見部分腫瘤向椎管外侵犯，呈啞鈴狀生長，極少數腫瘤生長于髓內。IS好發節段依次為腰骶段、胸段及頸段，常累及脊神經感覺根，造成責任節段平面以下出現感覺異常等癥狀，嚴重者可出現尿便失禁。由于IS的發病機制尚未被闡明，藥物等非手術治療手段無法實施，因此，在顯微鏡下完成腫瘤全切或次全切成為該腫瘤唯一而有效的治療方法。然而，手術往往伴隨多種并發癥，在一定程度上影響了患者的預后和臨床治療滿意度〔1〕。研究表明，腫瘤的生物學行為受多種微小RNA(miR)的調控。miR是在真核生物中發現的一類內源性且具有調控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸。其作用機制主要是通過結合mRNA而實現降解或阻遏mRNA翻譯過程這一效應〔2〕。研究表明，miR-17-92作為一個高度保守的基因簇與機體造血系統、生殖系統、消化系統及神經系統等腫瘤的生長關系密切〔3～5〕。miR-17-92基因簇由6種成熟的miR組成，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，且對腫瘤調控作用表現為抑癌或促癌效應〔6〕。本研究通過檢測IS組織中miR-17-92的表達情況，分析其作為生物治療靶點的可能性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2016年5月至2018年5月廈門大學附屬福州第二醫院收治的20例IS患者腫瘤組織標本(實驗組)。 其中男15例，女5例，平均年齡(50.40±10.65)歲。病變節段：頸段3例，胸段6例，腰段9例，骶段(S1)2例。腫瘤直徑<2.0 cm 5例，≥2.0 cm且<5.0 cm 14例，≥5.0 cm 1例。腫瘤位于髓外硬脊膜下15例，脊髓內2例，硬脊膜兩側即啞鈴型3例。所有患者的首發癥狀表現為神經根性疼痛伴感覺異常，未出現括約肌功能障礙。所有患者臨床資料完整，結合術前磁共振成像(MRI)(含增強影像)、術中確認腫瘤起源及術后病理明確診斷(圖1，圖2)。對照組12例標本取自截肢患者的神經組織(主要為腓總神經)。本研究所有程序經過廈門大學附屬福州第二醫院及西安醫學院倫理委員會批準，并且告知患者相關權利和風險，由本人或其法定監護人簽署知情同意書。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 將標本分為兩部分：一部分腫瘤標本送病理組織學檢查，另一部分置于液氮中保存。經病理檢查確診為IS后，采用RT-qPCR分別檢測腫瘤組織及正常神經組織中miR-17-92基因簇的表達水平。

1.2.1RNA提取 使用Invitrogen公司的TRIzol Reagent (目錄號：10296010)提取組織標本總RNA，并在核算分析儀上檢測A260/A280，當其值介于1.8～2.0時，可認為總RNA質量較佳。取1 μl RNA樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳80 V×20 min，觀察總RNA的5 S、18 S和28 S rRNA條帶，3條條帶完整即證明總RNA抽提較完整。

1.2.2miR-17-92基因簇引物設計及合成 采用Oligo7.56軟件設計miR-17-92基因簇及內參基因GAPDH引物序列，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

A:MRI T2W矢狀位顯示腫瘤位于C1～C2節段(紅色箭頭)；B:術中可見腫瘤起源于神經，且少部分腫瘤已長入椎間孔(白色箭頭)；C:纖維鏡下完整切除腫瘤，大小為4.5 cm×3.5 cm×1.8 cm，質地較軟，包膜完整，色澤灰白圖1 椎管內神經鞘瘤

A:鏡下可見部分腫瘤細胞呈束狀緊密排列，形成Antoni A結構(紅色箭頭)，而部分細胞則呈稀疏紊亂排列，形成Antoni B結構(黑色箭頭，HE染色×200)；B：免疫組織化學顯示S-100可使腫瘤細胞呈棕褐色(×200)圖2 術后病理情況

基因名稱引物名稱引物序列(5'-3')長度(bp)退火溫度(℃)miR-17-92正向CTGTCGCCCAATCAAACTG24660反向GTCACAATCCCCACCAAACGAPDH正向GGGTGTGAACCATGAGAAGT14260正向GGCATGGACTGTGGTCATGA

1.2.3cDNA合成及PCR擴增 cDNA合成體系：采用Promega公司莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶逆轉錄試劑盒(目錄號：M3681)，建立25 μl反應體系：M-MLV RT 5×反應緩沖液5 μl，脫氧腺苷三磷酸(dATP，10 mmol/L)1.25 μl，脫氧胞苷三磷酸(dCTP，10 mmol/L)1.25 μl，脫氧鳥苷三磷酸(dGTP，10 mmol/L)1.25 μl，脫氧胸苷三磷酸(dTTP，10 mmol/L)1.25 μl，M-MLV RT 1 μl，焦碳酸二乙酯水補至總體積為25 μl。PCR在25 μl體系進行：DNA模板100 ng/μl，正、反向引物各1 μl(10 μmol/L)，2×Taq Plus PCR MasterMix 12.5 μl，雙蒸水補至25 μl。每個樣本設置3個復孔。ABI SimpliAmp 熱循環儀進行擴增反應。PCR反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行30個循環，72℃延伸5 min。取5 μl PCR產物，以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行結果檢測。

1.2.4相對定量分析 RT-qPCR采用相對定量法，以GAPDH為內參，校正每個樣品的Ct值，得△Ct。目標基因表達水平可利用2-△△Ct法獲得，△△Ct =各組(Ct目的基因-Ct內參基因)-對照組(Ct目的基因-Ct內參基因)=X，2-△△Ct=各組基因表達量/對照組基因表達量。結果表示，各組樣本內目標基因的表達水平為對照組樣本內的2-X倍。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1患者術后及預后 實驗組中17例術后癥狀緩解，順利出院，3例(15%)出現并發癥，包括腦脊液漏、切口感染、急性血腫及上肢感覺功能減退等。采取加強硬脊膜縫合、抗感染等治療措施后康復出院，平均住院(8.46±3.84)d。

2.2miR-17-92基因簇表達 對照組miR-17-92基因簇表達水平(1.414±0.152)顯著高于實驗組(1.048±0.168，t=3.582，P<0.05)。

2.3miR-17-92基因簇表達上調與未上調兩組間一般資料比較 miR-17-92基因簇表達上調與未上調兩組間年齡及腫瘤大小差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 miR-17-92基因簇表達上調與未上調患者間年齡、腫瘤直徑的比較

3 討 論

神經鞘瘤是一種可發生于全身任何部位的腫瘤，25%～45%腫瘤分布在頭頸區域，29%分布于椎管內，還有部分可見于外周神經、腹膜后、椎旁肌肉等〔7，8〕。其中IS絕大多數屬于良性腫瘤，是最常見的椎管內腫瘤〔9〕。其生物特性主要表現為生長均勻緩慢，部分腫瘤在生長過程中可停滯甚至萎縮。在發病早期一般無任何臨床癥狀，當腫瘤增大到一定程度后，可壓迫與之毗鄰的脊髓和(或)神經根而出現神經源性疼痛，嚴重者可致癱瘓。研究表明，IS年發病率為(0.4～1.5)/10萬，呈逐年上升趨勢，且發病人群越來越廣泛〔10〕。目前，關于神經鞘瘤發病機制的研究鮮有報道，且尚無統一結論，成為非手術治療神經鞘瘤的瓶頸，特別是對只能實施腫瘤次全切除術的患者，術后腫瘤存在復發或惡變的可能性。

流行病學研究表明，神經鞘瘤發病具有遺傳傾向性，其遺傳易感基因主要是神經纖維瘤Ⅱ型(NF2)基因〔11〕。在雙側聽神經瘤患者中，90%以上都存在NF2基因突變，臨床將其作為明確的診斷指標之一〔12〕。在周圍神經鞘瘤中，約70%發病與NF2基因突變有關〔13〕。雖然IS多為散發，且尚未找到遺傳學相關證據，但先前的研究表明，NF2基因在IS中也存在突變，這種突變使其編碼的Merlin蛋白失去活性，進而喪失腫瘤抑制作用〔14〕。在miR研究方面，現代醫學研究認為miR是非編碼小分子RNA，在機體發育、生理、病理過程及腫瘤發生、進展等環節中起著重要的調節作用。郭建新等〔15〕發現，在神經鞘瘤中，miR-10b啟動子甲基化水平下降，進而引起該基因持續高表達，致使第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因靶向表達受到抑制。隨著研究的深入，miR分子被證實參與了腫瘤進展的調控。在眾多被揭示的miR分子中，miR-17-92基因簇無疑是最具代表性的分子之一，參與了全身多種實體腫瘤的發生、發展過程，包括甲狀腺癌、生殖系統腫瘤、血液系統腫瘤、消化系統腫瘤及神經源性腫瘤等〔16,17〕。本研究揭示了miR-17-92基因簇可能參與了IS的發生、發展，對后續進一步研究該腫瘤發病機制及尋找非手術治療方法具有重要意義。

目前，國內外學者對IS的研究主要聚焦于如何更加微創地完成腫瘤全切除，減少并發癥，卻忽略了對該腫瘤發病機制的研究及非手術治療途徑的探索。可能是由于絕大多數臨床醫生認為，90%以上的IS都可以經手術切除，且預后較好。然而手術并不能解決一切問題。Formo等〔18〕研究表明，即使顯微鏡下微創切除IS是一種安全、有效的治療方法，但術后并發癥發生率卻高達11%，包括腦脊液漏、術區淺表感染、神經功能減退等。本研究中1例術后12 h出現肢體癱瘓、感覺功能減退，經MRI證實為急性血腫形成，及時予以血腫清除后，患者肢體運動和感覺功能恢復。此外，對高頸段啞鈴型IS而言，由于腫瘤往往包繞著椎動脈，很難完成腫瘤全切，殘余的腫瘤又會造成復發、惡變等問題〔19〕。當前治療IS的主流術式是經后路全椎板或半椎板切除+顯微鏡下腫瘤切除〔20〕。然而，此種入路破壞了脊柱的穩定性，造成脊柱出現滑脫、前凸或后凸畸形等問題。Cusick等〔21〕研究發現，切除一側關節突，在屈曲或負重的情況下，脊柱的強度可下降31.6%。由此可見，手術雖然能夠有效治療IS，但在治療的過程中給患者帶來了新的問題。

綜上，IS雖然是一種良性腫瘤，外科干預能夠取得較為滿意的治療效果，但手術畢竟是一種有創性的治療手段，隨之帶來的近期或遠期并發癥給患者造成了極大的心理、經濟負擔，生存質量下降，因此，探究IS的發病機制、調控機制是十分必要的。本研究不足之處在于尚未找到miR-17-92基因簇所調控的靶基因及其下游分子的調控機制。在未來的研究中將致力于尋找有效的生物治療靶點，為非手術治療椎管內神經鞘瘤提供參考。