低溫萘降解菌的篩選、鑒定及降解條件優化

郭亞男 張馨予 胥夢 王繼華

（哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150025）

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種具有兩個或多個苯環的有機污染物，在環境中廣泛存在［1］。主要來源于森林火災、火山噴發或化石燃料的不完全燃燒［2-3］。由于PAHs具有低溶解度，高疏水性，高辛醇-水分配系數（KOW）和降解的頑固性等特性，使其在環境中積累到高水平，在我國東北污灌區、天津地區等部分地區土壤中均有檢出［4-6］。迄今已發現200多種PAHs，美國環境保護署列舉出16種優先修復的PAHs，萘為其中一種，萘因具有揮發性使它更容易與受體接觸，導致患溶血性貧血、皮膚病、視網膜炎及細胞癌變等疾病［7-9］。土壤中的萘可被植物吸收，進入食物鏈，對人類健康和生態系統構成嚴重威脅［10］。微生物修復是一種治理環境污染的有效方法，與其他方法相比，經濟、高效且無二次污染［11-13］。只要正確的利用微生物群體，它們便利用土壤中的萘作為碳源和能源進行生長，且細菌的運動能夠為生物修復提供一種更快速、更均勻地降解萘的手段［14-16］。

根據文獻調研，PAHs污染北方較南方嚴重，冬季PAHs的排放量大約是夏季的1.6倍［17］。國內城市土壤中的PAHs主要來源于高溫燃燒源和石油源所構成的混合型污染［18］。我國北方年平均氣溫低于15℃，在此溫度下許多最佳生長溫度在20℃及以上的萘降解菌無法發揮其降解能力，而在15℃或以下恰恰是低溫微生物的最適生長溫度。因此，篩選對萘具有強降解能力的低溫微生物是十分必要的。而北方土壤內的土著菌已長期適應了寒冷環境，因此篩選萘的低溫降解菌，選擇北方地區石油污染較嚴重的地區作為降解菌株的源土壤。大慶市，別稱油城，是一座以石油、石化為支柱產業的著名工業城市。但是在開采過程中無法避免石油泄漏問題，由此產生萘污染的環境問題日益嚴重。并且該區域的日平均氣溫低于15℃，持續6-9個月。因此，研究從黑龍江省大慶油田地區污染土壤篩選能以萘為唯一碳源和能源的降解菌，研究降解菌在萘-無機鹽培養基中對萘的降解情況；得到高效降解菌對其進行鑒定；對高效降解菌的生長條件進行優化；同時分析降解階段其主控因素。旨為在低溫條件下利用微生物修復技術治理PAHs污染提供優良菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 土樣取自黑龍江省大慶市紅崗區圖強西街油田石油污染土壤表層（0-10 cm），地理坐標為：緯度46.522217，經度124.945595。采用五點采樣法取樣后帶回實驗室，過20 mm篩，保存于4℃冰箱。

1.1.2 主要培養基 LB液體培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa滅菌20 min。LB固體培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2，1×105Pa滅菌20 min。檸檬酸鹽實驗培養基：NH4H2PO41 g，K2HPO41 g，NaCl 5 g，MgSO40.2 g，檸檬酸鈉 2 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，1%溴香酚藍乙醇溶液，10 mL，1×105Pa滅菌20 min。無機鹽培養基：（NH4）2SO40.5 g，Na2HPO4·2H2O 3.5 g，MgCl2·6H2O 0.1 g，Ca（NO3）2·4H2O 0.05 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL，1×105Pa滅菌20 min。萘-無機鹽培養基：將萘溶解于正己烷溶液，待正己烷完全揮發，萘晶體析出后，加入預先滅菌的無機鹽培養基均勻混合。

1.2 方法

1.2.1 低溫降解菌馴化、分離及篩選方法 微生物的馴化過程是通過人為措施使得微生物逐步適應某種環境，最后獲得具有較高耐受力和活力的菌株。萘對菌體有一定的毒害作用，最大污染物濃度馴化法使得能夠適應該污染物濃度的菌株存活下來，并隨著馴化的進行漸漸適應該環境而進行生長繁殖。取5 g土樣裝入含有200 mL萘-無機鹽培養基（萘濃度200 mg/L）的錐形瓶中，10℃，120 r/min振蕩培養，7 d后觀察培養液變化。按體積10%的接種量轉接到新鮮萘-無機鹽培養基中，萘濃度增加至400 mg/L，此后，萘的質量濃度按600、800、1 000 mg/L逐步提升。吸取5代培養液采用稀釋涂布法分離純化，選擇菌落生長較好的菌株在萘-無機鹽固體培養基上劃線復篩，-80℃甘油保存。

1.2.2 萘降解率的測定

1.2.2.1 菌懸液的制備 將所得菌株接入LB液體培養基中，10℃、120 r/min振蕩培養，選擇對數期菌株離心收集細菌（10 000 r/min，6 min），用無菌水重復沖洗3次，用無機鹽培養基將菌懸液調節至所需菌濃度。

1.2.2.2 菌株對萘的降解 將所得菌株接入200 mL的萘-無機鹽液體培養基（萘濃度為300 mg/L）中，在10℃、120 r/min下振蕩培養，3個重復，設立不接菌液為對照組。24 h取樣一次。取樣吸取5 mL樣品加入裝有2 g氯化鈉和5 mL正己烷溶液的離心管中，用旋渦混合器混勻2 min，離心（5 000 r/min，5 min），轉移上清液正己烷層至玻璃小瓶中。再用5 mL正己烷重復上述萃取過程后，合并上清液用無水Na2SO4脫水，30℃旋轉蒸發，氮吹1 mL以下，正己烷定容至1 mL，待測。

Agilent 7890/5975C-GC/MSD檢測程序設定：進樣口溫度280℃，分流進樣，載氣：氦氣（高純），流量 1 μL/min（恒流），進樣量 ：1.0 μL，色譜柱DB5-MS（15 m×0.25 mm，0.1 μm），升溫程序：80℃，保持2 min；以20℃/min升至180℃，保持5 min；再以10℃/min速率升至240℃，保持5 min。質譜條件：離子源溫度、離子化能量、接口溫度、四極桿溫度分別為230℃、70 eV、280℃和150℃，溶劑延遲5 min，離子檢測（SIM）模式。

1.2.2.3 萘的標準曲線 萘儲備液按照梯度稀釋，分別稀釋配制成濃度為20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的溶液。用氣相色譜-質譜法測定萘各濃度時對應的峰面積，以萘各梯度標準液濃度為X，對應的峰面積為Y，制作萘標準線Y=2613.9X-7146.4，標準曲線R2=0.999。

1.2.3 低溫降解菌的鑒定

1.2.3.1 形態學觀察及生理生化特征 所得菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，10℃培養7 d，在光學顯微鏡下觀察細胞形態、菌體大小。生理生化實驗結果參照鑒定手冊［19］。

1.2.3.2 16S rDNA基因序列測定與系統進化關系的分析 利用細菌基因組提取試劑盒（HaiGene，B0135）提取細菌DNA，并利用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對細菌 16S rDNA基因進行PCR擴增。50 μL擴增體系為：DNA模板 2 μL，Super Taq DNA Polymerase 0.5 μL，10×Hi PCR Buffer 5.0 μL dNTP Mixture 4.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L） 和 PCR Reverse Primer（10 μmol/L）各 PCR Reverse Primer（10 μmol/L），ddH2O Up to 50 μL。PCR 擴增程序為：94℃ 5 min；94℃30 s；51℃ 1 min 30 s，72℃ 2 min 30 s，30 個循環 ；72℃ 10 min。經篩選后的菌株送至哈爾濱瑞博興科生物技術有限公司完成16S rDNA測序工作。通過MEGA 7.0軟件Alignment中的CLUSTAL W對目的序列和參考序列進行比對，根據比對結果選擇Bootstrap test of phylogeny并用Neighbor-joining構建系統發育樹。

1.2.4 降解菌生長曲線的測定 將所得菌株接入200 mL的LB液體培養基中，10℃、120 r/min振蕩培養，4 h取樣1次，3個重復，設立不接菌液為對照組（CK）。用UV759CRT紫外分光光度計測吸光值（OD600）表示菌株的生長量。

1.2.5 降解菌培養條件的優化 萘-無機鹽液體培養基作為基礎培養基，對萘濃度、培養溫度、初始pH、培養轉數進行單因素試驗，測量菌液OD600。在單因素試驗基礎上，添加時間因素，按正交試驗L18（35）五因素三水平共18組試驗對菌株搖瓶培養條件進行優化，每組3個重復。

1.2.6 數據處理 利用 IBM SPSS Statistics 20.0 統計軟件對實驗結果進行統計學分析。

2 結果

2.1 低溫萘降解菌的篩選

從黑龍江省大慶油田附近污染土壤中，采用污染物濃度馴化法進行菌株的馴化。在馴化后期以萘為唯一碳源（1 000 mg/L）富集體系中初篩，富集過程初始溶液為無色，從2 d開始有顯色變化，變為橙色，顏色逐漸加深。富集體系結束后將富集液采用稀釋涂布法涂LB培養基平板，選擇菌落生長較好的菌株在萘-無機鹽固體培養基中復篩，最終得到5株以萘為唯一碳源生長的低溫菌株。

2.2 低溫萘降解菌降解能力的結果與分析

對5株低溫萘降解菌在萘-無機鹽液體培養基（萘濃度300 mg/L）中培養10 d，萘的降解情況測定如圖1所示。1號菌對萘污染物的毒性適應能力較強，呈勻速上升趨勢，具有較好的降解能力。2號菌初期能較快降解萘，72 h之后降解速率下降，降解率增長緩慢。3號和4號菌各階段降解趨勢基本保持一致，相對于其他菌株具有更強的降解能力，降解速度從培養初期即開始上升，第1天至3天上升得最快，3 d后上升的速度減緩。與培養初期相比，4 d內在添加3號菌和4號菌的處理中，在對照組非生物因素影響基礎上，萘的降解率達94.43%和95.47%，在耐受能力和降解速度方面具明顯優勢。5號菌相比較于其他菌株適應能力較慢，但經過一定時間后，降解率持續增加。根據不同菌株在低溫條件下對萘的適應能力以及自身生長狀況，最終選擇3號和4號菌作為下一步研究對象進行研究。并將3號、4號菌命名為GN1和GN2。

圖1 不同低溫萘降解菌降解能力測定

2.3 低溫萘降解菌的鑒定

采用形態觀察及生理特性對GN1和GN2菌株初步鑒定，結果見表1。

菌株GN1和GN2系統發育樹結果如圖2所示。根據16S rDNA序列同源性比對，GN1和GN2皆與假單胞菌屬（Pseudomonassp.）同源性最近，序列相似性均高達99%。綜合菌株的形態觀察、生理生化特性及16S rDNA序列比對分析，可確定GN1和GN2均屬于假單胞菌屬。GN1和GN2所測序列提交到GenBank數據庫，獲得序列登錄號分別為MK208705和 MK208706。

2.4 低溫萘降解菌的生長曲線

菌株GN1和GN2的生長曲線見圖3，2株菌均適宜在LB液體培養基中生長，GN1、GN2從接種到第8小時細菌生長緩慢，延滯期較短；從8 h到60 h，細胞數量急劇增加，處于對數生長期；60 h后，隨著培養基中各種物質的消耗，細菌細胞密度變化不大，細菌進入穩定期。其中GN1生物量略高于GN2。

表1 GN1和GN2降解菌的形態及生理生化特征

2.5 菌株GN1和GN2培養條件優化

菌株GN1和GN2培養條件單因素優化，結果見圖4。GN1和GN2最優單因素培養條件均為：萘-無機鹽培養基（萘濃度300 mg/L），pH 7.0，培養溫度10℃，培養轉數120 r/min。

根據單因素試驗結果，選擇合適的因素和水平（表2），按正交試驗L18（35）對菌株GN1、GN2搖瓶培養條件進行優化，所得數據應用SPSS 20.0進行方差分析，菌株GN1結果見表3。各因素各水平之間差異顯著，說明各個因素之間具有交互作用，5個因素對菌株GN1生長影響的強弱順序為：培養時間＞培養轉數＞培養溫度＞初始pH＞萘濃度。水平之間差異顯著，進行多重比較，結合單因素統計量表（未給出）可得，GN1的最佳搖瓶培養條件組合為A3B3C1D3E3，即萘濃度300 mg/L，培養溫度15℃，初始pH 6.0，培養轉數180 r/min，培養時間7 d，在此條件下萘的去除率達到99.1%。菌株GN2結果見表4，同理，5個因素對菌株GN2生長影響的強弱順序為：培養轉數＞培養溫度＞培養時間＞初始pH＞萘濃度，GN2的最佳搖瓶培養條件組合為A3B3C1D3E3，即萘濃度300 mg/L，培養溫度15℃，初始pH 6.0，培養轉數180 r/min，在此條件下，萘的去除率達到99.8%。

圖2 基于16S rDNA基因序列同源性的GN1和GN2系統發育樹

圖3 降解菌株生長曲線

表2 正交試驗環境因素和水平的設計

表3 GN1正交試驗的方差分析

表4 GN2正交試驗的方差分析

3 討論

微生物修復技術已成為人們選擇去除環境中萘的首要辦法和手段，篩選出能夠降解萘的菌株是該技術的關鍵環節［20］。大量研究表明多個菌屬的細菌可對多數有機物進行降解，尤其是假單胞菌屬，如孟建宇等［21］從烏梁素海水中篩選出一株假單胞菌，在10 d內可降解質量濃度為3.5 g/L的萘。但是目前研究多數萘的降解菌最適生長溫度通常為25-37℃，低溫萘降解菌的研究卻鮮見報道。本研究對篩選出的低溫萘降解菌測定其降解效率時發現，在未加菌液的對照組中，萘的濃度也有所降低，在控制其他環境因素（萘濃度、溫度、pH和轉數）一致的情況下，可能是由于在降解過程中體系不是完全的密閉以及在取樣過程中的揮發所造成的；同時在降解過程中可能存在光化學降解，Bertilsson［22］對淡水中多環芳烴的光化學降解及其對細菌生長的影響-水化學的影響進行研究，結果發現：在實驗期間，觀察到存在光化學誘導所致的萘消耗，因此萘可能會發生光降解，此實驗萘的光降解速率實驗結果與本實驗對照組中可能由于光降解產生的降解結果類似。綜合這兩方面，可能是本實驗對照組降解率略高的原因。有關多環芳烴降解菌降解效率的研究，多數在實驗中沒有加入空白組對照，這可能也是日后研究需要關注的地方。在低溫條件下GN1和GN2可以快速降解萘，在對照組非生物因素影響基礎上，萘（300 mg/L）的降解率在4 d內達到94.43%和95.47%，在耐受能力和降解速度方面具明顯優勢。為低溫條件下利用微生物修復技術治理PAHs污染提供了優良菌株資源，同時降解動態研究曲線也為菌株投入實際應用提供了時間參比。

圖4 不同培養條件對菌株GN1、GN2生長的影響

東北地區是我國重要的老工業基地之一，能源消耗較大，各類燃料的燃燒效率較低，且氣候寒冷，取暖期漫長，常溫菌無法發揮降解作用，由此產生的萘污染以及自然過程和人為過程導致土壤酸化問題日益嚴重［23-25］。在過去的20年中國土壤pH平均下降0.5個單位［26］。污染和酸化已成為土壤生態系統的兩大威脅。本研究富集篩選出的菌株GN1、GN2能在低溫（0-15℃）、偏酸（pH 6.0）和萘質量濃度為50-300 mg/L的條件中正常生長。因此，GN1、GN2菌具有較好的研究價值和應用前景。

正交試驗設計（Orthogonal experimental design）是研究多因素多水平的一種設計方法。正交試驗設計多用于培養條件的優化，如Qingmiao等［27］采用正交試驗對E2降解菌降解條件進行優化，針對低溫萘降解菌培養條件的優化，目前尚未見相關研究報道。本研究在低溫萘降解菌單因素試驗結果的基礎上，利用正交試驗設計對萘-無機鹽培養基中萘濃度、培養溫度、初始pH、培養轉數、培養時間5個因素進行優化，所得數據應用SPSS 20.0進行方差分析。正交試驗結果與單因素試驗結果存在差異，因各因素之間存在著交互作用，正交試驗結果更具有說服力，利用正交設計篩選組合結果可靠，方法可行。同時降解菌株的生長與五因素均有顯著關系，利用正交試驗分析影響萘降解的主控因素，在實際土壤萘污染治理過程中，依據環境因素，合理選擇菌株并優化調控手段實現土壤萘污染高效修復。

4 結論

（1）從黑龍江省大慶油田地區污染土壤篩選出2株在低溫條件下高效降解萘的菌株，編號為GN1和GN2。在對照組非生物因素影響基礎上，萘（300 mg/L）的降解率在4 d內達到94.43%和95.47%，顯示出在低溫條件下較強降解萘的能力。（2）菌株GN1和GN2經形態觀察、生理生化特性和16S rDNA基因序列鑒定皆屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。（3）菌株GN1和GN2的最佳培養條件均為：萘-無機鹽培養基（萘濃度300 mg/L），培養溫度15℃，初始pH 6.0，培養轉數180 r/min，培養時間7 d，去除率分別達到99.1%和99.8%。（4）菌株的生長與五因素均有顯著關系。在實際土壤萘污染治理過程中，依據菌株降解最適條件，優化調控手段實現土壤萘污染高效修復。