解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌物質分離及對灰葡萄孢抑菌作用研究

劉超 劉洪偉 汪步青 趙雯雅 王雅娜 張麗萍

（1. 河北工業大學，天津 300000；2. 河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；3. 河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心，石家莊 050081）

芽孢桿菌（Bacillus）由于能產生多種胞外生物活性物質，在醫藥、食品、農業及工業領域有著廣泛的應用前景［1］。產生的胞外抑菌活性物質可分為由核糖體途徑合成的抑菌物質：細菌素、抗菌蛋白、幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶和由非核糖體途徑合成的抑菌物質：表面活性素、伊枯草素、芬薺素、聚酮類化合物等［2］。其中，細菌素及表面活性素、伊枯草素、芬薺素及抗菌蛋白類物質的研究較多［3］。從解淀粉芽孢桿菌FZB42中分離的環狀細菌素（Amylocyclicin）對革蘭氏陽性細菌有較好抑制作用［4］；解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM 產生的細菌素（PPB），能抑制李斯特氏菌、沙門氏菌和志賀氏桿菌。楊瑞先等［5］分離到兩株解淀粉芽孢桿菌Md31和Md33對牡丹病原菌有良好抑制效果，所產脂肽類粗提物也具有較強的體外抑菌活性。郭繼平等［6］篩選到的一株解淀粉芽孢桿菌生防菌能分泌多種抗菌蛋白并對葡萄霜霉病有抑制作用。關于解淀粉芽孢桿菌抗菌物質的分子結構、功能特性及應用研究，集中在多種抑菌活性物質，對單一物質的研究缺乏。

解淀粉芽孢桿菌產生的不同抑菌活性物質其抑菌作用機制不同。細菌素可影響細胞膜的滲透壓［7］，幾丁質酶可降解真菌的細胞壁［7］，β-1，3-葡聚糖酶通過水解β-1，3-糖苷鍵破壞真菌細胞壁［8］。表面活性素能改變細胞膜通透性使細胞內離子流出［9］，伊枯草素能使真菌菌絲分解和抑制孢子萌發［10］，芬薺素有良好的脂溶性能與細胞膜磷脂層反應［11］等。潘虹余等［12］發現解淀粉芽孢桿菌 B15 產生的伊枯草素A和芬薺素以協同作用誘導細胞凋亡的形式來抑制灰葡萄孢菌絲的生長。但不同抗菌物質對灰葡萄孢的作用效果和作用機制有待進一步研究。

本實驗室在前期篩選到一株解淀粉芽孢桿菌BA-26其代謝產物抑菌活性強，研究表明具有酸堿穩定性、熱穩定性和蛋白酶穩定性［13］。本研究分離純化了菌株BA-26胞外抑菌物質并將初步分離的粗提物及純化后的抗菌物質對灰葡萄孢進行抑菌作用研究。了解此菌株發酵液中抑菌物質存在情況和抑菌作用機制，為其進一步應用尤其在防治植物病原真菌病害方面的應用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）BA-26、番茄灰霉病菌（B. cinerea）來自于河北省科學院生物研究所微生物研究室。

1.1.2 主要試劑和儀器 Amberlity XAD-7HP大孔樹脂，美國Sigma公司；乙腈、甲醇和三氟乙酸為美國Fisher Chemical色譜純試劑；LC-20A HPLC系統，日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株BA-26胞外抗菌物質的分離純化

1.2.1.1 硫酸銨鹽析 采用硫酸銨沉淀法制備抗菌粗提物。取菌株BA-26培養48 h的無菌發酵液2 L，加入硫酸銨固體使飽和度達到60%，4℃靜置12 h，然后8 000 r/min離心30 min，收集沉淀和上清液，取沉淀溶于5 mL無菌水，檢測抑菌效果。此沉淀即為抗菌粗提物（Antibacterial crude extract，A）。

1.2.1.2 大孔樹脂吸附法 取由2 L發酵液所得的抗菌粗提物，以 600 mL的無菌水溶解，加入20-60目大孔樹脂200 g，4℃下搖勻12 h。樹脂經過濾收集后，用蒸餾水洗滌3次，再分別用200 mL 10%、20%、30%……100%乙醇（V/V）依次洗滌［14］。收集各組分洗脫液，在旋轉蒸發器中42℃減壓蒸干。收集蒸干組分分別溶于5 mL無菌水于4℃保存備用。

1.2.1.3 高效液相色譜法 采用SHIMADZU LC-20A高效液相色譜分析進一步純化［15］。流動相A為含0.1%（V/V）三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.1%（V/V）三氟乙酸的超純水。將大孔樹脂分離樣品加載到WondaSil C18 4.6 mm×150 mm、粒徑5 μm色譜柱中，以10%-90%乙腈為線性梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為214 nm。收集各保留時間所對應的組分，經氮吹濃縮，冷凍干燥后稱重，于-20℃保存備用。

1.2.2 抗菌物質的抑菌活性測定

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1.2.2.1 對病原真菌活性測定 采用平板對峙法，將50 mL病原真菌孢子懸液（1×106CFU/mL）與300 mL 融化的PDA培養基混合均勻后，倒入培養皿中，待凝固后，均勻打孔直徑為8 mm。每孔加100 μL待測物質，于26± 1℃下培養2-4 d，觀察是否有抑菌圈產生并測量抑菌圈直徑大小。每個處理重復3次。

1.2.2.2 對細菌活性測定 于平板上挑取細菌單菌落，接種至裝有30 mL LB培養基的100 mL錐形瓶中，37℃，180 r/min培養14 h。采用平板傾注法［16］，將細菌菌液與LB固體培養基混合均勻，在含菌平板上均勻打孔直徑為8 mm。每孔加100 μL待測物質，37℃培養20 h，測量抑菌圈直徑大小。每個處理重復3次。

1.2.3 BA-26活性組分對灰葡萄孢菌絲的影響 挑取灰葡萄孢菌絲于載玻片上，用無菌生理鹽水沖洗后，用超純水溶解濃度為1 mg/mL的活性組分處理灰葡萄孢菌絲6 h，無菌生理鹽水沖洗后用0.04%臺盼藍染色30 min，置于顯微鏡下觀察。以未經處理的菌絲為對照，每個處理重復3次。

1.2.4 BA-26活性組分對灰葡萄孢孢子萌發的影響 采用凹玻片懸滴法制片觀察。分別取少量BA-26活性組分，用超純水溶解制成1 mg/mL的溶液。各取50 μL無菌活性組分溶液與50 μL液體PDA 培養基混合，再與100 μL灰霉孢子懸液（1×106CFU/mL）混合后于無菌凹玻片上26 ± 1℃培養，每6 h后使用顯微鏡觀察孢子萌發情況。以未經處理的孢子為對照，每個處理重復3次。

1.2.5 BA-26活性組分的最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法［17］配制濃度為 3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00和 1000.00μg/mL的抗菌物質組分，各取100 μL加入瓊脂孔中。置于26 ± 1℃培養2 d后，分別測量抑制區半徑來確定對菌絲體的抑制效果。以70%的乙腈水溶液為對照，每處理組分重復3次。

1.2.6 統計分析 實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件分析處理，以平均值±標準差表示，經Duncan氏新復極差法檢驗，不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異顯著。

2 結果

2.1 菌株BA-26抗菌物質分離純化及抗菌粗提物的抑菌譜

2.1.1 硫酸銨鹽析 對菌株BA-26無菌發酵液，進行硫酸銨鹽析。以番茄灰霉病菌為指示菌，硫酸銨鹽析后上清液和無菌水為對照，檢測抑菌活性。研究結果（圖1）表明，不同飽和度的硫酸銨鹽析時，沉淀和上清液的抑菌活性不同，在硫酸銨飽和度為60%時獲得沉淀抗真菌活性最強，并且上清液沒有抑菌活性。為達到將盡可能多的活性物質沉淀的效果，選擇飽和度為60%作為制備抗菌粗提物的最佳硫酸銨濃度。

2.1.2 菌株BA-26抗菌粗提物的抑菌譜 飽和度為60%硫酸銨沉淀獲得抗菌粗提物檢測結果（表1）顯示：菌株BA-26抗菌粗提物對所試12種真菌都有十分明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均在15.7 mm以上。其中接骨木鐮刀菌、番茄早疫病菌、立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、蘋果輪紋病菌、三七病原菌、米曲霉菌的抑制作用很強，抑菌圈直徑分別達到34.7、36.3、40.0、30.3、30.7、39.3和30.4 mm；而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒有抑菌作用。菌株BA-26抗菌粗提物中的抑菌物質主要為抗真菌物質，該抑菌物質抑菌譜廣。

圖1 解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌粗提物活性檢測

2.1.3 大孔樹脂分離結果分析 硫酸銨沉淀獲得的抗菌粗提物經大孔樹脂吸附分離，除未吸附的組分外，共得到了10個組分，即A1-A10。由表2可知，不同分離組分表現出不同的抑菌活性，經體積分數為60%乙醇水溶液洗滌后的組分A6的抗真菌效果最好。比較每一級組分抑菌活性大小，發現抑菌物質集中出現在中間這些級分，說明存在的抑菌活性物質可能兼有親水性和親脂性的特點。選擇抑菌活性最強的A6組分進一步分離純化。

2.1.4 反相高效液相色譜法分離純化結果分析 采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進一步純化結果見圖2。活性物質A6 組分在不同波長下進行檢測，在214 nm 處有較大吸收峰，所以選擇檢測波長為214 nm。菌株BA-26活性組分A6中至少有34類組分，即A6-1-A6-34。它們中大部分都不是單一峰，表明它們不是單一物質。這與芽孢桿菌產生的抗菌物質中可能存在很多結構相似的異構體和同系物，很難分離到單一物質的特征相符。將這34類組分冷凍干燥后用70%乙腈水溶液溶解進行抑菌活性追蹤。檢測結果發現，對應保留時間為29 min時的A6-15組分和保留時間為34-43min時的A6-19-A6-28各組分具有抗真菌活性。

表1 解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌粗提物對不同病原真菌的抑菌直徑

表2 解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌粗提物分離組分對番茄灰霉病菌的抑菌圈直徑

圖2 菌株BA-26抗菌粗提物分離組分A6的反相高效液相色譜圖及活性峰檢測

2.1.5 活性組分對灰葡萄孢的抑菌作用 將經RPHPLC分離的活性組分，配制成濃度為1 mg/mL的溶液并檢測抑菌活性。由圖3可知，不同組分的抗菌物質對灰葡萄孢抑菌作用不同，其中A6-19組分抑制效果最好，抑菌圈直徑達27.4 mm，A6-20組分的抑菌圈直徑為27.1 mm與之相比無顯著差異；A6-21組分抑菌圈直徑為24.8 mm強于A6-22、A6-27和A6-28這些相互之間抑菌效果無差異組分；A6-22、A6-23、A6-24、A6-25組分的抑菌效果無顯著差異，它們的抑菌圈直徑分別為23.3、23.2、22.8和22.7 mm；A6-26組分抑菌效果相對較弱抑菌圈直徑為21.0 mm；A6-15組分抑菌效果低于所有組分抑菌圈直徑為17.9 mm。說明菌株BA-26的主要抗菌物質存在于A6-19-A6-28這些組分。

2.2 菌株BA-26胞外活性物質對灰葡萄孢抑菌作用研究

2.2.1 活性組分對灰葡萄孢菌絲形態的影響 如圖4中所見，經抗菌物質處理培養6 h后觀察，未經抗菌物質處理的灰葡萄孢菌絲形態飽滿，表面光滑，正常生長并向四周擴展，在分生孢子梗末端觀察到孢子的產生（圖4-A）。A6-15組分處理的菌絲，菌絲形態變化不明顯，與對照相比菌絲結構完整，僅能觀察到菌絲明顯彎曲，未出現膨大變粗，也未觀察到菌絲內容物外流（圖4-B）。而A6-19-A6-28這些組分在其抗菌物質的作用下菌絲形態變化明顯，表現出相似的特征，菌絲細胞畸形，菌絲體彎曲變粗，中部腫脹，頂端膨大，分枝菌絲生長受阻（圖 4-C，4-D）。

2.2.2 活性組分處理灰葡萄孢菌絲后臺盼藍染色臺盼藍染色結果顯示：未經處理的菌絲形態正常未被染色（圖5-A）；A6-15組分處理的灰葡萄孢菌絲未被染色（圖5-B）；A6-19-A6-28這些組分處理的灰葡萄孢菌絲生長受阻，有明顯的膨大，部分菌絲出現較大的囊泡部分，經臺盼藍染色后，鏡檢時發現菌絲呈現藍色（圖5-C）。說明A6-19-A6-28這些組分抗菌物質的作用機制可能與破壞灰葡萄孢菌絲的細胞膜有關。

圖4 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分對灰葡萄孢菌絲形態的影響

圖5 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分處理灰葡萄孢菌絲臺盼藍染色

2.2.3 活性組分的最小抑菌濃度 測定A6-15和A6-19-A6-28各組分對灰葡萄孢的MIC，結果如表3所示。A6-19-A6-28這些組分對灰葡萄孢的抗菌作用高于A6-15組分。其中，A6-19和A6-20組分對灰葡萄孢的抗菌活性最強，最小抑菌濃度為7.81 μg/mL。

表3 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分對灰葡萄孢的MIC值

2.2.4 活性組分對灰葡萄孢孢子萌發的影響 經活性物質處理的灰葡萄孢孢子培養36 h后觀察其萌發抑制情況。由圖6可知，未經處理的孢子萌發明顯，長出相當于孢子徑6-10倍的菌絲（圖6-A）；A6-15組分對灰葡萄孢孢子萌發的抑制作用最強，從培養開始至36 h時，均未萌發，但未觀察到有孢子破裂（圖6-B）；A6-19-A6-28這些組分對灰葡萄孢孢子萌發的抑制作用仍相對較強，培養至12 h時有少量孢子萌發，36 h時萌發菌絲長度僅相當于孢子徑的2-4倍，已萌發的菌絲膨大變粗（圖6-C）。

圖6 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分對灰葡萄孢孢子萌發抑制情況

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是革蘭氏陽性需氧型桿菌，產生的生物活性物質豐富。Ashokkumar等［18］從紅樹林生態系統中分離出解淀粉芽孢桿菌VCRC B483通過80%硫酸銨沉淀獲得的粗提物顯示對鐮刀菌屬和新月彎孢霉屬的抗菌活性；盧彩鴿等［19］從漠河多年永凍土層中分離的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌MH71，對多種植物病原真菌和細菌具有較強的拮抗作用，發酵液對番茄灰霉病的防效為92.8%。本研究中BA-26菌株的抗菌粗提物顯示出強的抗不同真菌活性，對立枯絲核菌的抑菌活性最強，抑菌圈為40.0 mm。菌株BA-26的次級代謝產物對大部分病原真菌有顯著抑菌效果，具有開發為新型生防制劑的潛力。

關于芽孢桿菌抗菌物質的抑菌作用研究，通常是通過制備無菌發酵液或抗菌粗提物進行。潘虹余等［12］探究了解淀粉芽孢桿菌B15發酵液對葡萄病原菌灰葡萄孢的抑菌機理，然而由于抗菌物質種類較多，對于某一種物質的抑菌作用并不清楚。本實驗發現解淀粉芽孢桿菌BA-26發酵液中產生的抗菌物質對灰葡萄孢菌絲生長發育的影響，主要表現在菌絲畸形膨大變粗、分支菌絲生長受阻、細胞膜被破壞通透性增加。此外，最強抗真菌活性物質的最小抑菌濃度為7.81 μg/mL，對灰葡萄孢孢子萌發抑制效果明顯。

顯微鏡觀察結果顯示，經A6-15組分處理的菌絲，菌絲形態變化不明顯，未出現膨大變粗，也未觀察到菌絲內容物外流。但A6-19-A6-28這些組分在其抗菌物質的作用下菌絲形態變化明顯，表現出明顯的抑制作用，菌絲細胞畸形，菌絲體彎曲變粗，中部腫脹，頂端膨大，分枝菌絲生長受阻。本實驗中11種活性組分的濃度均為1 mg/mL，已達到其最小抑菌濃度。此實驗結果可能是由于A6-15組分中抗菌物質的最小抑菌濃度比A6-19-A6-28這些組分明顯高造成的，A6-15組分中的抗菌物質能否使真菌菌絲形態發生相似的改變，還需在不同濃度下進行實驗驗證。而在活性組分對孢子萌發影響的實驗中，觀察到相反結果，雖然A6-15組分中抗菌物質的最小抑菌濃度比A6-19-A6-28這些組分明顯高，但A6-15組分中抗菌物質對孢子萌發抑制作用更強。不同抗菌物質之間是否存在協同抑菌作用，不同濃度下對真菌菌絲和孢子萌發的抑制作用有無差異，還有它們都有哪些作用機制。這些問題都將是未來的研究方向。

從解淀粉芽孢桿菌的次級代謝產物中分離抗菌物質的報道，朱弘元［20］在對解淀粉芽孢桿菌B15有效抑菌成分研究時發現了親水性和親脂性的脂肽類物質，包括iturin A及其同系物、fengycin和surfactin類物質，穩定性研究表明酸堿、溫度和酶處理對抑菌活性沒有太大影響。本研究通過硫酸銨沉淀、大孔樹脂吸附及反相高效液相色譜技術，從解淀粉芽孢桿菌BA-26的發酵液中分離純化到11類抗真菌物質，液相分析峰圖顯示它們不是單一物質，這與芽孢桿菌產生的抗菌物質中可能存在很多結構相似的異構體和同系物的特征相符。這些抗菌物質易溶于水和極性有機溶劑的混合物，具有一定的親水性和親脂性。下一步，擬通過質譜、紅外光譜、核磁共振等現代波譜技術對液相色譜分離各組分活性物質進行結構鑒定。

4 結論

從解淀粉芽孢桿菌BA-26發酵液中分離純化到11個具有抑制真菌作用的活性組分。該菌株抗真菌譜廣，對立枯絲核菌等多種植物病原真菌有強抑制作用，高效液相色譜純化活性組分中對灰葡萄孢抑菌活性最強的最小抑菌濃度為7.81 μg/mL。菌株BA-26產生的抗真菌活性物質能使灰葡萄孢菌絲生長受阻、膨大變粗、細胞膜破壞并能抑制其孢子萌發。