海洋高產(chǎn)尿酸氧化酶菌株篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

張慶芳 逄飛 于爽 肖景惠 竇少華 遲乃玉

（1. 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622；2. 遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，大連 116622）

尿酸（Uric acid）是鳥類、高等靈長類、蛇類、蜥蜴類等生物體嘌呤代謝的最終產(chǎn)物［1］。科學(xué)研究表明：當(dāng)高等靈長類動物體內(nèi)嘌呤代謝異常時，尿酸積累過多，將引發(fā)痛風(fēng)、高血壓［2］、心血管疾病［3］、糖尿病［4-5］、腎臟病［6］等多種疾病。因此尿酸水平可作為這些疾病發(fā)生的重要指標(biāo)。檢測血液中尿酸含量對高尿酸血癥引起的相關(guān)疾病的治療和診斷具有重要意義。常用檢測尿酸的方法有酶法［7］、伏安法［8］、鎢磷酸還原法［9］、高效液相色譜法。其中，酶法具有高靈敏度，操作相對簡單快速的特點［7］。因此，開發(fā)一種來源廣泛、成本低廉、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的尿酸氧化酶試劑盒十分必要。

尿酸氧化酶（Uricase，Uric acid oxidase，EC.1.7.3.3），又稱為尿酸酶，其是一種參與嘌呤降解途徑的氧化酶［7，10］，可快速將尿酸氧化成尿囊素近而排出體外［11］。盡管尿酸氧化酶在生物中廣泛分布［12］，但由于基因突變，使高等靈長類（人和猿類）生物中缺失尿酸氧化酶編碼基因，導(dǎo)致其體內(nèi)無法合成此酶［13-14］。當(dāng)尿酸在體內(nèi)積累，相關(guān)疾病接踵而來，尿酸氧化酶便是檢測該類相關(guān)疾病的有效藥物［15］。因此，尿酸診斷試劑盒的開發(fā)成為近年來的新興熱點。尿酸快速診斷試劑盒可對人體血清尿酸進行實時監(jiān)測，及時控制尿酸水平，更加方便快捷準(zhǔn)確的預(yù)防高尿酸血癥的發(fā)生［16］。

尿酸氧化酶最早被Schittenhelm發(fā)現(xiàn)，來源于牛的腎臟［17］。隨后，研究人員從微生物中發(fā)現(xiàn)了尿酸氧化酶，極大地豐富了尿酸氧化酶的來源［18］。現(xiàn)階段，大多數(shù)的尿酸氧化酶菌株都是從土壤樣品中篩選得到的［19-21］，如黃曲霉（Aspergillus flavus）［22］、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）［23］、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）［24］、枯草芽孢桿菌 ZX（Bacillus subtilis）［25］、 微 桿 菌 屬 ZZJ4-1（Microbacteriumsp.）［26］等。其中來源為曲霉的尿酸氧化酶已上市，但其產(chǎn)量及酶活較低，且價格昂貴。因此，開發(fā)新來源的尿酸氧化酶極為迫切。海洋是一個獨特的生境，來源于海洋的尿酸氧化酶具有低溫、高效性等應(yīng)用優(yōu)勢。因此，本實驗以黃海海泥海水為研究對象，篩選出穩(wěn)定高酶活的低溫尿酸氧化酶菌株，進行尿酸氧化酶的分離純化以及其酶學(xué)性質(zhì)初探，以期為尿酸氧化酶藥劑、新型尿酸檢測試劑盒的開發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化提供菌種來源并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 大連黃海海域海泥、海水樣品，取樣深度5-20 m。

1.1.2 試劑 酵母膏提取物、牛肉膏提取物、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖、尿酸、牛血清白蛋白 生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（g/L）：尿酸5，酵母膏 0.5，NaCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，pH 7.5，121℃高壓滅菌；初篩培養(yǎng)基（g/L）：尿酸5，酵母膏0.5，NaCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，瓊脂 15，pH 7.5，121℃高壓滅菌；復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：尿酸5，酵母膏3，NaCl 0.1，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，pH 7.5，121℃高壓滅菌；平板培養(yǎng)基（g/L）：尿酸5，酵母膏3，NaCl 0.1，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，瓊脂15，pH 7.5，121℃高壓滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基：同復(fù)篩培養(yǎng)。

1.1.4 設(shè)備與儀器 CRY-2112 立式恒溫搖床：上海茸研儀器有限公司；LTI-700 低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-600S 三用恒溫水箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SCIENTZ-650E超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；CR21N 高速冷凍離心機：株式會社日立制作所；Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；Bio Log MicroStation III全自動微生物鑒定儀：美國Bio Log有限公司；FP-1100-C Bio screen全自動生長曲線分析儀芬蘭Growth curves Ab Ltd公司；DHG-9070電熱恒溫鼓干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

1.2.1.1 初篩 準(zhǔn)備若干個無菌100 mL三角瓶，并向其加入50 mL無菌生理鹽水。將收集的海水、海泥（海泥2.0 g、海水2 mL各15份）樣品加入三角瓶中，振蕩混勻10 min，靜置30 min。將2 mL樣品溶液的上清液接種到富集培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d。同樣的方法定向富集3次。將富集的菌液進行梯度稀釋，分別涂布于初篩固體培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)3 d。隨時觀察菌落形態(tài)，及透明圈大小（菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈作為初篩標(biāo)準(zhǔn)）。選取出現(xiàn)透明圈的菌落用于進一步純化，并保藏菌株用于后續(xù)實驗。

1.2.1.2 復(fù)篩 將初篩菌株接種于200 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)36 h，測定尿酸氧化酶活性，并從初篩菌株中篩選出具有最高尿酸氧化酶活性的菌株。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 平板點樣法獲得單菌落，觀察單菌落形態(tài)。通過革蘭氏染色法對菌體染色，并在光學(xué)顯微鏡（10×100）下觀察。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》進行鑒定［27］。

1.2.2.2 生理生化特征通過 Biology微生物鑒定系統(tǒng)進行生長實驗與化學(xué)敏感實驗［28］；部分生理生化鑒定參見《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》［27］。

1.2.2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定 將復(fù)篩得到的尿酸氧化酶高產(chǎn)菌株送交生工生物（上海）有限公司，對其16S rDNA進行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［29］。

1.2.3 粗酶液制備方法 將發(fā)酵液8000 r/min離心15 min，通過離心獲得的濕菌經(jīng)pH 8.5的硼酸緩沖溶液洗滌3次以上，直至發(fā)酵液洗凈為止。將洗后的菌體懸浮在pH 8.5的硼酸緩沖溶液中，并在冰浴條件下超聲波破碎，能量30%，每次破碎3 s，間隙3 s，破碎30 min。將菌體破碎液12 000 r/min離心15 min，上清液為粗酶液。

1.2.4 酶活測定方法 將粗酶溶液（0.1 mL）與含有2 mmol/L尿酸的0.6 mL硼酸鈉緩沖液（pH 8.5，0.1 mol/L），0.15 mL 4-氨基安替比林（30 mmol/L），0.1 mL苯酚 1.5%，0.05 mL過氧化物酶（15 U/mL）加入到25 mL比色管中，25℃孵育10 min。然后通過加入1.0 mL乙醇終止反應(yīng)，并用去離子水補足至20 mL。空白對照：將粗酶液替換為硼酸鈉緩沖溶液。通過分光光度計讀取540 nm處的吸光度［17］。酶單位定義為：在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下每分鐘可產(chǎn)生1.0μmol H2O2所需的酶量。

1.2.5 酶的分離純化

1.2.5.1 鹽析［30-31］取10 mL經(jīng)破碎離心處理后的粗酶液分別加入到50 mL離心管中，根據(jù)硫酸銨飽和度表，將相應(yīng)質(zhì)量的硫酸銨加入離心管中，使硫酸銨飽和度達到30%-90%，將經(jīng)處理過的粗酶溶液置于冰箱，4℃過夜，然后以12 000 r/min離心15 min，1 mL緩沖液進行溶解蛋白沉淀。

1.2.5.2 透析和超濾 將通過鹽析獲得的粗制酶液置于預(yù)處理好的透析袋中，并置于冰箱，4℃進行透析。將透析后的粗制酶液轉(zhuǎn)移到10 kD超濾管中進行離心超濾。

1.2.5.3 Sephadex G-100凝膠過濾層析純化尿酸氧化酶 Sephadex G-100凝膠柱（1.6 cm×60 cm）用10 mmol/L PBS（pH=7.4）平衡，2 mL超濾后酶溶液上樣，以0.3 mL/min的流度加載；收集洗脫液每管1 mL直至無洗脫峰為止。記錄每個管樣品的A280并測定尿酸氧化酶活性。收集在280 nm處具有酶活的流分，冷凍干燥后在-20℃儲存。

在上述各步驟中，均需測定尿酸氧化酶活性及蛋白質(zhì)濃度，計算酶比活、回收率及純化倍數(shù)。

1.2.5.4 SDS-PAGE電泳檢測純度 經(jīng)上述純化步驟得到的初步提純的酶液，進行SDS-PAGE電泳，其中12%的分離凝膠，5%的濃縮凝膠，30 mA恒流電泳2.5 h，電泳凝膠經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色和脫色溶液脫色，分析實驗結(jié)果。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.6.1 酶最適作用溫度 將初步提純的酶液分別置于10-70℃（每隔5℃設(shè)定一個梯度），根據(jù)尿酸氧化酶的酶活力測定方法測定酶活性，并計算相對酶活性。

1.2.6.2 酶的熱穩(wěn)定性 將初步提純的酶液置于20-50℃水浴（每10℃設(shè)定一個梯度），保溫60 min。根據(jù)尿酸氧化酶活力測定方法，25℃下，每10 min測定尿酸氧化酶殘留酶活性，并計算相對酶活性。

1.2.6.3 酶最適作用pH 在酶最適作用溫度條件下，將初步提純的酶液置于不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）的緩沖液中，測定尿酸氧化酶活性，并計算相對酶活性。

1.2.6.4 酶的pH穩(wěn)定性 配制pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液，分別將初步提純的酶液置于其中，25℃孵育60 min，測定尿酸氧化酶酶活性，并計算相對酶活性。

1.2.6.5 化學(xué)試劑對酶活影響 在酶作用最佳條件下，酶液中加入 Fe3+、Ca2+、Na+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ag+、Hg2+等金屬鹽離子，十二烷基硫酸鈉（SDS）及乙二胺四乙酸（EDTA）等化學(xué)試劑，各反應(yīng)體系中金屬離子的最終濃度為10 mmol/L，測定尿酸氧化酶酶活性，并計算相對酶活性。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

復(fù)篩過程中，得到一株高產(chǎn)尿酸氧化酶菌株，命名為 Z7，25℃下，其酶活約為12.1 U/mg，用甘油保藏法保藏于-20℃冰箱中，用于后續(xù)實驗。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 圖1是菌株Z7菌落及細胞形態(tài)特征圖。可見，菌落呈白色、圓形、不生孢子、不透明、邊緣整齊，表面光滑濕潤。另一方面，其微觀形態(tài)呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。

2.2.2 生理生化特征 本研究共測定了菌株 Z7 的103 項生理生化特性（表1），其中過氧化氫酶試驗為陽性。可利用D-麥芽糖、蜜二糖、D-松二糖等44種碳源。易被抑制的化學(xué)物質(zhì)有利福霉素SV、鹽酸胍、硫酸四癸鈉等15種。與模式株Bacillus fastidiosus的生理生化結(jié)果一致。

圖1 菌株Z7菌落形態(tài)（A）及顯微形態(tài)（B）（10×100）

表1 菌株Z7生理生化特征

2.2.3 16S rDNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 通過瓊脂糖凝膠電泳分析菌株Z7 16S rDNA擴增產(chǎn)物。由圖2可見，2泳道獲得一條清晰條帶，顯示與Z7 16S rDNA基因序列大小相一致，序列長度為1 392 bp。將菌株Z7的16S rDNA序列輸入美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中，通過Nucleotide BLAST 與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性最高的已知菌株序列進行比較。由MEGA 5以鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可知，菌株Z7與苛求芽孢桿菌Bacillus fastidiosus（NR 113989.1）同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株Z7為苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidiosus）。

2.3 尿酸氧化酶分離純化

2.3.1 Sephadex G-100凝膠過濾層析純化尿酸氧化酶 海洋低溫尿酸氧化酶粗酶溶液經(jīng)飽和硫酸銨鹽析，確定最佳硫酸銨鹽析濃度為75%；將其通過Sephadex G-100凝膠過濾層析進一步純化。隨著洗脫過程的進行，洗脫液在 280 nm處吸收值和尿酸氧化酶活力的變化見圖4。酶活力曲線（箭頭）顯示尿酸氧化酶組分主要在第17管被洗脫下來，約在33管時被完全洗脫，表明在出現(xiàn)該吸收峰的時間段內(nèi)收集的樣品為尿酸氧化酶產(chǎn)品。

2.3.2 尿酸氧化酶分離純化結(jié)果 結(jié)果表明：硫酸銨沉淀、透析超濾和Sephadex G-100凝膠過濾層析純化后，大部分蛋白質(zhì)被除去，獲得從苛求芽孢桿菌中初步提純的酶液尿酸氧化酶產(chǎn)品，酶活力為35.3 U，酶比活達 673.7 U/mg，純化倍數(shù)達15.6倍，酶活回收率達4.5%（表2）。SDS-PAGE電泳顯示，純化后尿酸氧化酶為單一蛋白條帶，表明其為單一尿酸氧化酶純品，分子量約為 33.1 kD（圖 5）。

圖2 菌株Z7 16S rDNA序列及圖譜

圖3 菌株Z7 16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 尿酸氧化酶分離純化結(jié)果

圖4 Sephadex G-100凝膠過濾層析

圖5 SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖6 尿酸氧化酶的最適作用溫度曲線

圖7 酶的熱穩(wěn)定性

2.4 酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶最適作用溫度 如圖6所示，25℃ 為尿酸氧化酶的最適反應(yīng)溫度，當(dāng)溫度上升至45℃ 時，尿酸氧化酶的酶活性急劇下降，但是尿酸氧化酶在10℃ 仍保留20%以上的酶活性，說明尿酸氧化酶帶有低溫酶特征。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性 由圖7可知，該尿酸氧化酶在20-30℃作用60 min后能保持較高酶活，說明其活性相對穩(wěn)定；雖然20℃酶活性略低于25℃，但其穩(wěn)定性優(yōu)于后者，說明該酶在低溫環(huán)境活性更加穩(wěn)定，符合低溫酶特征。從50℃開始，酶活急劇下降；50℃處理1 h，酶活基本為0。該尿酸氧化酶在高溫環(huán)境下穩(wěn)定性差。

2.4.3 酶最適作用pH 由圖8可知，該酶在pH 7.0-4.0時酶活迅速下降，在pH 8.0時酶活性最高，酶活性在pH 8.0-10.0時略有下降，說明尿酸氧化酶的最適酶促反應(yīng)pH為8.0，該酶屬于堿性酶。

2.4.4 酶的pH穩(wěn)定性 圖9可以看出，在pH 8.0緩沖溶液中作用60 min后的尿酸氧化酶活性基本沒有損失。當(dāng)緩沖液pH高于8.0時，酶活性開始下降。該酶在pH 8.0、9.0的緩沖液作用60 min還能保留80% 的相對活性，并且在pH 10.0時也保持50% 的相對活性。然而，該酶在pH 5.0和6.0時活性迅速降低，表明該酶是堿性酶。

2.4.5 化學(xué)試劑對酶活影響 由表3可知，Ag+、Hg2+對該酶抑制性較強，使尿酸氧化酶幾乎喪失活性。SDS對該酶抑制有一定的作用。Fe3+、Ca2+對該酶具有激活作用。Na+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、EDTA對該酶幾乎沒有影響。

圖8 pH對尿酸氧化酶的影響

圖9 pH對尿酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

3 討論

國內(nèi)外已報道了諸多微生物來源的尿酸氧化酶的分離和純化，其中大部分是胞內(nèi)酶［32］。在國外，Wang等［33］在1980年研究報道了鏈霉菌屬產(chǎn)生的尿酸氧化酶的分離純化，尿酸氧化酶純度提高1 000倍。Lucas等［34］在1983年分離純化了由根瘤菌產(chǎn)生的尿酸氧化酶，其最適pH為9.5，屬于嗜堿酶。Shaaban等［12］在2015年對127株銅綠假單胞菌株進行尿酸氧化酶酶活測定，篩選出酶活最高菌株，命名為PS43。將PS43菌株的尿酸氧化酶基因克隆表達，發(fā)現(xiàn)工程菌酶比活比野生菌提高了51倍。在國內(nèi)，孟堯等［35］于2006年對朊圓酵母產(chǎn)尿酸氧化酶進行純化，研究發(fā)現(xiàn)該酶具有較高的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。姚明明等［36］于2007年報道了利用雙水相萃取的技術(shù)分離尿酸氧化酶，酶回收率大幅度提高。2008年，武文明等［37］研究了假絲酵母中尿酸氧化酶的純化及其部分酶學(xué)性質(zhì)。綜上所述，研究人員已經(jīng)對很多來源的尿酸氧化酶進行了分離純化，其中一些尿酸氧化酶已經(jīng)形成了蛋白結(jié)晶。目前，這些酶的分離和純化均在實驗室中小規(guī)模制備，生產(chǎn)成本非常昂貴，不適合用于大規(guī)模生產(chǎn)。

因為尿酸氧化酶商品相對昂貴，且目前商業(yè)酶的穩(wěn)定性和活性均不理想，因此，國內(nèi)臨床使用尿酸氧化酶試劑盒主要依賴進口，國產(chǎn)尿酸氧化酶試劑盒應(yīng)用較少。本研究為豐富我國的醫(yī)藥市場、擺脫我國對尿酸氧化酶依賴于進口這一現(xiàn)狀提供了有力的技術(shù)支持，也為尿酸氧化酶試劑盒的進一步開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

表3 金屬離子與化學(xué)試劑對尿酸氧化酶酶活的影響

4 結(jié)論

本實驗從大連黃海海泥、海水中篩選1株高產(chǎn)尿酸氧化酶菌株Z7。分別通過形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列鑒定與分析，確定該菌株為苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidiosus）。依次采用硫酸銨鹽析、透析、超濾和Sephadex G-100凝膠過濾層析對菌株Z7所產(chǎn)尿酸氧化酶進行分離純化，并對其部分性質(zhì)進行初步研究。結(jié)論可知，菌株Z7產(chǎn)生的尿酸氧化酶分子量約為33.1 kD，酶比活為673.7 U/mg，純化倍數(shù)為15.6，酶活回收率達4.5%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，其最適作用溫度為30℃，最適pH為8.0。另外，F(xiàn)e3+、Ca2+對尿酸氧化酶具有激活作用，Ag+、Hg2+對該酶具有抑制作用，該菌株產(chǎn)酶活性及穩(wěn)定性良好，可為尿酸氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。