貓4種不同來源間充質干細胞的生物學特性比較

羅冬章 羅惠娜 詹小舒 李心怡 黃曼晴 林潔微 黃綺亮 洪純林好美 陳勝鋒 王丙云

（佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528231）

間充質干細胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，可從多種組織器官（骨髓、脂肪、胎盤和臍帶）中分離獲得。因其缺乏獨特的細胞膜表面標記，所以國際干細胞協會認為可以通過以下3個標準來辨別MSC，其中包括其生長貼壁性能、表達的一組細胞表面標志物與多向分化的潛能［1］。

目前，對人、鼠和狗等的MSC生物學特性研究較多，而關于貓MSC的生物學特性的信息較少。2002年，Martin等［2］首次從貓骨髓中分離獲得MSC，通過對細胞的形態學、細胞分化能力和細胞表面標記物的研究，發現貓骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSC） 與嚙齒類或人類來源的BM-MSC非常相似。隨后不斷有人從不同來源的組織中分離獲得MSC。Jin等［3］研究表明貓臍帶來源的間充質干細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）和骨髓來源的BM-MSC對神經損傷治療是有效的。Quimby等［4］的研究發現，貓自體BM-MSC和脂肪間充質干細胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSC）移植可治療貓慢性腎臟疾病。骨髓來源的MSC的生長活性和產量受到貓年齡的影響，而AD-MSC的活性更好和細胞產量更多。由此可見，不同來源的貓MSC對疾病的治療有一定的效果，但其機制仍需進一步的研究。本研究從貓脂肪、骨髓、臍帶和胎盤等4種不同組織中提取MSC，系統地比較它們的生物學特性，為后續的臨床應用篩選種子細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 本實驗所取得的脂肪、骨髓、羊膜、臍帶均來自于一只1歲的健康母貓（家貓），體重約7 kg。取樣地點于佛山科學技術學院獸醫院二樓。

1.1.2 主要試劑 0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、磷酸緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）和青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購自Hyclon（美國）；胎牛血清購于BioInd（以色列），DMEM/LOW培養液、間充質干細胞成骨、成脂誘導液購于Cyagen（中國）；CD44購自ThermoFisher（美國）、CD34和CD90購自 BDPharmingenTM（ 美 國 ）、CD105購 自 GeneTex（美國）。

1.1.3 主要儀器設備 流式細胞儀購自Beckman Coulter（美國），超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司（中國），HHS型電熱恒溫水浴鍋購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠（中國），離心機Eppendorf（德國），倒置顯微鏡購自OLYMPUS公司（日本），CO2培養箱購自Shel Lab公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分離、培養

1.2.1.1 BM-MSC的分離、培養 通過無菌術，抽取貓骨髓液0.5 mL于抗凝管中，加入2.5 mL含雙抗的PBS緩沖液稀釋，制成3 mL骨髓稀釋液。1 500r/min冷凍離心10 min，然后小心吸取下層血細胞，加入含1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中，混勻制成細胞懸液，接種至60 mm2細胞培養皿中。將細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細胞長滿80%-90%，進行傳代。

1.2.1.2 AD-MSC的分離及培養 通過無菌術，取貓皮下脂肪約拇指指甲蓋大小，放于含有雙抗PBS的15 mL離心管內。取到的脂肪在無菌操凈臺內依次用75%酒精浸泡3次，每次3 s，PBS洗2次，最后使用含雙抗的PBS洗滌兩次。然后剪碎約為1 mm2大小的組織塊，剪碎后轉移至15 mL離心管中，加入兩倍體積的濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，于37℃水浴鍋中消化30 min，終止消化。消化液用200目細胞篩過濾，濾液以1 200 r/min離心5min，棄去上清液。加入含1% L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中，混勻制成細胞懸液，接種至60 mm2細胞培養皿中。將細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細胞長滿80%-90%，進行傳代。

1.2.1.3 UC-MSC的分離及培養 取剛生產的母貓產后胎盤，在無菌操凈臺內小心剝離臍帶組織，用75%酒精浸泡3次每次3 s，再用PBS洗2次，最后使用含雙抗的PBS洗滌2次。剪碎后轉移至15 mL離心管中，加入5倍體積的濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，于37℃培養箱中消化6 h，消化液用200目細胞篩過濾，濾液1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入含1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中，混勻制成細胞懸液，接種至60 mm2細胞培養皿中。將細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細胞長滿80%-90%，進行傳代。

1.2.1.4 AM-MSC的分離培養 取剛生產的母貓產后，在無菌操凈臺內小心剝離羊膜組織，用75%酒精浸泡3次每次3 s，再用PBS洗2次，最后使用含雙抗的PBS洗滌2次。剪碎后轉移至15 mL離心管中，加入5倍體積的濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，于37℃培養箱中消化1 h，消化液用200目細胞篩過濾，濾液1 200 r/min離心5min，棄上清，加入含1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM，混勻制成細胞懸液，接種至60 mm2細胞培養皿中。將細胞置于37℃，5% CO2培養箱中培養48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細胞長滿80%-90%，進行傳代。

1.2.2 細胞生長曲線及計算倍增時間 取生長良好的P3、P6和P9代數的細胞，用胰酶消化后，制成細胞懸液，以2×104個/mL的細胞密度接種0.5 mL于24孔培養板中，放置在37℃、5%CO2培養箱中培養。以后每間隔 2-3 d換一次液。24 h后開始進行細胞計數，以后每間隔24 h計數一次，每次隨機抽取3個孔進行計數，結果取3個孔的平均值，連續計數8 d。根據細胞計數統計的結果，以單位細胞密度作為縱坐標（個/mL），時間為橫坐標來繪制生長曲線。根據公式1，計算細胞生長的倍增時間。

其中：t為細胞培養的時間（h），Nt是培養t時間后細胞的數量，N0是初始接種的細胞數量。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞表面標記 取P3代的4種細胞，待細胞長至80%時，用0.25%的胰酶消化、用含10%FBS的培養基終止，調整細胞數為1×106個，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加PBS緩沖液清洗2次、1 200 r/min離心5 min。分別加入抗體CD34、CD44、CD90和CD105，室溫孵育20 min，1 h內上機檢測。

1.2.4 成脂成骨誘導分化

1.2.4.1 成脂誘導分化 分別取P3代的4種細胞，接種到24孔板，置于38.5℃、5%CO2培養箱培養。每3 d進行換液，等到細胞融合達到80%-90%時，用吸管吸取、棄掉舊培養液，每孔加入0.5 mL的成脂誘導分化A液開始進行誘導，連續培養2 d，2 d后更換為成脂誘導分化B液，繼續培養1 d，1 d后再更換為成脂誘導分化A液進行誘導，2 d后更換一次為成脂誘導分化B液，如此重復幾個循環。2周后可看到脂滴，當脂滴出現較多、脂滴增大時進行油紅O染色。

1.2.4.2 成骨誘導分化 分別取P3代的4種細胞，接種到24孔板，置于38.5℃、5%CO2培養箱培養。每3 d進行換液，等到細胞融合達到80%-90%時，用吸管吸取、棄掉舊培養液，每孔加入0.5 mL的成骨分化液進行培養。以后每隔3 d換液一次，誘導細胞分化持續1-2周。經過1-2周的誘導后，在顯微鏡下觀察到有鈣結節形成，再進行茜素紅染色。

1.3 數據分析

本實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行分析，兩獨立樣本比較采用獨立樣本t檢驗，不同組間采用單因素方差分析，數據用均數±標準差表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

在倒置顯微鏡下觀察，原代細胞培養在48 h換液后，4種細胞均可以看到有細胞貼壁，大部分細胞形態呈圓形、多邊形梭形，少數細胞呈不規則形狀，折光性弱。

AD-MSC在第7天時，細胞融合達到90%，細胞生長時呈圓形、短梭形增殖，增殖速度較快。BM-MSC細胞在培養的前5 d可見少量的細胞死亡，在第7 天時細胞融合達到90%，細胞呈長梭形、多棱形、旋渦狀生長。

AM-MSC和UC-MSC的細胞，可見部分不規則胞質散大、折光性弱的細胞，在培養的過程中死細胞較多，在第12天時細胞才融合90%，且細胞胞質較大，折光性較BM-MSC和AD-MSC差（圖1）。

2.2 生長曲線

根據繪制的4種MSC的生長曲線（圖2）可知，4種細胞在接種的前2 d增殖比較緩慢。AD-MSCC和BM-MSC在第3天開始進入對數生長期，AD-MSC到P9代依然保持良好活性；P6和P9代BM-MSC在第7天進入平臺期，第8天開始衰退；AM-MSC和UC-MSC的增殖速度慢，不出現對數生長期，細胞增殖呈線性生長，P6和P9代細胞在第5天開始進入平臺期，第7天開始衰退。根據細胞計數結果，計 算AD-MSCC、BM-MSC、AM-MSC和 UC-MSC的群體平均倍增時間（表1）。

圖1 四種不同來源的MSC細胞生長形態（標尺=100 μm）

表1 四個不同來源MSC的P3，P6和P9的細胞倍增時間（±S，n=3）

表1 四個不同來源MSC的P3，P6和P9的細胞倍增時間（±S，n=3）

注：不同小寫字母表示差異顯著性，P ＜0.05

AD-MSC BM-MSC AM-MSC UC-MSC P3 30.46±1.50a 36.51±2.50ab 55.85±3.34c 58.06±2.68cd P6 34.35±2.09ae 43.23±2.40f 113.20±7.14g 98.98±3.39h P9 37.0±1.73bei 81.16±2.56j 128.08±5.34k 105.59±4.40l

2.3 MSC免疫熒光鑒定

流式細胞檢測結果（圖3，表2）顯示，4種細胞表面CD44、CD90和CD105均是強陽性表達，而CD34低表達。

2.4 成脂成骨分化鑒定

在成骨誘導分化液的作用后，細胞形態發生變化。培養7 d后，顯微鏡下觀察，4種細胞均能看到鈣結節生成。經茜素紅染色后，呈紅色。BM-MSC第5天出現鈣結節，出現最早，其他3種細胞出現的時間一樣。

在成脂誘導分化液分化后，細胞形態發生變化。AD-MSC在分化第11天出現脂滴；BM-MSC第15天出現脂滴；UC-MSC和AM-MSC第23天出現脂滴，但脂滴較小，成脂率不高。經油紅O染色液染色后，可以看到細胞中的脂滴被染成深鮮紅色（圖4）。

圖2 四種不同來源MSC的P3、P6和P9的生長曲線

3 討論

MSC是來自胚胎早期發育的中胚層，存在于許多組織器官，具有很強自我更新和分化能力，既有向骨、軟骨、脂肪和肌肉等中胚層組織細胞分化的潛能，也有分化為外胚層的細胞和內胚層細胞的能力［5-6］。研究表明，MSC除了具有自我更新和分化的能力，還具有抗炎、免疫調節、分泌多種細胞因子、抗凋亡及促增殖等作用，在修復損傷、調節免疫、減緩器官衰老、治療退行性疾病及支持造血系統等方面發揮重要作用，在各種疾病的預防和治療中具有較廣闊的應用前景［7-9］。隨著組織工程的發展，MSC移植治療也逐漸成為治療疾病的一種新方式、新手段。但MSC的體外分離培養及大量擴增是臨床應用的前提。因此，本文就貓不同來源的MSC的分離培養方法、細胞生長特性、多向分化性和細胞表型進行了研究。

圖3 四種不同來源MSC表面標記鑒定結果

表2 四種不同來源MSC表面標記表達率

圖4 四種不同來源MSC的成骨、成脂分化結果（標尺=100 μm）

MSC擁有諸多優點，可以成為細胞治療的種子，但是如何獲得更多、更純、活性更好的細胞依然是研究的熱點。目前，MSC的分離方法有：免疫磁珠分選法、密度梯度分選法、全骨髓貼壁法、組織消化法等［10］。本研究中，骨髓的分離采用了全血培養法，可以減少分離液等因素對細胞的傷害；其他3種細胞均采用Ⅰ型膠原酶消化法，膠原酶消化比較溫和，可減少對細胞的傷害，為后續細胞的培養和生物學特性研究提供保障。對細胞生長特性分析，幾種細胞的生長形態相近，以多邊形、梭形等不規則圖形貼壁生長，與報道的結果一致［11-13］。通過繪制生長曲線發現，AD-MSC的活性最好，增長速度最快，群體倍增時間最短，但隨著傳代次數的增加，細胞數和細胞的增長速度有所下降；BM-MSC的活性和增長速度次之；通過原代、傳代培養及細胞生長曲線比較，我們發現AM-MSC和UC-MSC的細胞活性較差，細胞胞質相對較大，折光性差。同ADMSC和BM-MSC相比，這些可能就是這兩種細胞數較少，倍增時間較長的原因。本研究發現AD-MSC的增長活性在P3代時最好，細胞傳至P9的時候仍保持良好增殖活性。有研究表明，體外培養MSC細胞可傳至P20代以上，因此MSC可以在體外大量的擴增培養，可以為臨床研究應用提供足量的細胞［14］。

MSC是一種分化潛能較高的中胚層細胞，對MSC的分化潛能研究主要是成骨、成脂和成軟骨分化能力［15］。我們研究發現，不同組織來源的MSC的分化潛能也存在一定差異，AD-MSC和BM-MSC的成骨成脂出現時間較短；AM-MSC和UC-MSC成脂分化時間較長而且成脂率不高。這些結果提示，AD-MSC和BM-MSC的成骨成脂分化能力較強。除此之外，根據報道，不同來源的MSC表型存在很高的相似性，如表達CD29、CD44、CD 73、CD 90和CD 105等，不表達或弱表達CD 14、CD 34和CD 45［16-18］。本研究對細胞表面分子 CD44、CD90、CD105和CD34進行分析，結果發現分離的4種MSC均能表達CD44、CD90、CD105，低表達CD34，該結果與報道的研究結果相一致［3-4，11，17］。盡管貓AD-MSC在生長能力和分化潛能上有著比其他組織來源的強，但其臨床應用的優勢怎樣，還有待進一步研究。

4 結論

本實驗建立貓的臍帶、羊膜、骨髓和脂肪來源的MSC的分離培養體系，并獲得了具有有貼壁生長特性以及分化為成脂成骨的能力和細胞表面高表達CD105、CD90、CD44 3種細胞表面標志物，低表達CD34的MSC。4種細胞中，AD-MSC的增長活性最好，細胞傳至第9代的時候依然保持良好的增殖活性，提示AD-MSC的臨床應用可能比較好。