利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)應(yīng)用于兒童肺結(jié)核快速診斷的效果

黃 晴

(武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核科，湖北 武漢 430040)

兒童是結(jié)核病易感人群之一，全球每年新發(fā)兒童結(jié)核病病例約達53.5萬，占所有新發(fā)病例的10%～15%[1]。早期明確診斷、及時治療對改善患兒預(yù)后尤為重要。近年來，核酸檢測技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷上引起臨床廣泛關(guān)注，研究顯示，該檢測技術(shù)在兒童結(jié)核病快速診斷中的敏感度達40%～60%[2]。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)(Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF)為眾多研究證實在成人肺結(jié)核診斷中敏感度、特異度均較高，但關(guān)于其在兒童肺結(jié)核中的報道極為少見[3，4]。本研究旨在探討Xpert MTB/RIF在快速診斷兒童肺結(jié)核中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2013年6月至2017年12月我院收治經(jīng)臨床診斷的120例肺結(jié)核患兒，均符合兒童肺結(jié)核診斷標準[5]，取樣前均無抗結(jié)核治療史，符合支氣管鏡檢查適應(yīng)證，患兒監(jiān)護人均簽署研究知情同意書。年齡3個月至14歲，中位年齡7歲。

1.2 檢測方法

1.2.1標本采集 應(yīng)用Olympus BF-P260F型纖維支氣管鏡。檢查前，根據(jù)患兒年齡選擇麻醉方式，其中≤7歲者選用異丙酚靜脈復(fù)合麻醉，>7歲者應(yīng)用利多卡因氣管內(nèi)黏膜表面麻醉。使患兒行仰臥位，支氣管鏡由鼻腔入，對病變情況進行仔細檢查后，采取導(dǎo)管由病灶部位注入一定量0.9%NaCl溶液，留取肺泡灌洗液。取適量肺泡灌洗液，均分為二份，一份留待行羅氏培養(yǎng)，一份留待行Xpert MTB/RIF檢測，余下肺泡灌洗液冷凍備存。

1.2.2羅氏培養(yǎng) 參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[6]中相關(guān)方法流程，進行結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗。

1.2.3Xpert MTB/RIF檢測 向所采集的肺泡灌洗液中加入等體積消化液，振搖數(shù)次。室溫下靜置10～15 min，待洗液可見成分消失時，抽取2 ml，置入Xpert MTB/RIF反應(yīng)試劑盒中，接著將反應(yīng)試劑盒置入4通道Gene Xpert平臺中，運行120 min后觀察結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果，并對陽性標本行利福平耐藥檢測。整個過程嚴格按試劑盒說明書進行。試驗結(jié)果采用盲法進行評價，計算兩種檢測方法的陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件處理研究數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果120例灌洗液，羅氏培養(yǎng)顯示，25例陽性，陽性率為20.83%(25/120)；Xpert MTB/RIF檢測顯示，74例顯示陽性，陽性率為61.67%(74/120)。羅氏培養(yǎng)的25例陽性標本中，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌陽性率為96.00%(24/25)，95例陰性標本中，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌陽性率為52.63%(50/95)。兩種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=44.672，P<0.05)，見表1。本研究由于未缺少非結(jié)核桿菌組，故不評價Xpert MTB/RIF檢測的特異性。

表1 兩種方法檢測結(jié)果對比 (n)

2.2 Xpert MTB/RIF方法的檢測次數(shù)對最終檢測結(jié)果的影響經(jīng)羅氏培養(yǎng)顯示陽性而采取Xpert MTB/RIF進行第一次檢測結(jié)果有3例顯示陰性，行第二次檢測其中2例得到陽性結(jié)果，靈敏度為96.00%(24/25)，與首次檢測的88.00%(22/25)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 兩種方法檢測利福平耐藥結(jié)果羅氏培養(yǎng)25例陽性標本經(jīng)比例法藥敏試驗顯示利福平耐藥者3例，耐藥率達12.00%(3/25)；比例法藥敏顯示的3例耐藥標本中，經(jīng)Xpert MTB/RIF檢測均顯示耐藥，敏感度為100.00%(3/3)；而比例法藥敏顯示的22例敏感者中，經(jīng)Xpert MTB/RIF檢測顯示有1例耐藥，特異度為95.45%(21/22)。

3 討論

自抗結(jié)核藥物問世以來，結(jié)核病預(yù)后得以明顯改善，然而近年隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重，結(jié)核病又出現(xiàn)重新蔓延，再次成為全球性公共衛(wèi)生問題。及早明確診斷并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果予以針對性治療具有重要意義。目前，羅氏培養(yǎng)及比例法藥敏試驗雖是診斷耐藥性肺結(jié)核的“金標準”，但培養(yǎng)周期長達4～8周，藥敏試驗亦需4周方可取得結(jié)果，較多患者因未能及時取得診治而延誤病情，導(dǎo)致不良預(yù)后甚至造成患者死亡[7]。兒童肺結(jié)核患者較成人負擔(dān)更重，報道顯示，20%以上經(jīng)培養(yǎng)證實的結(jié)核病患兒在未取得有效治療前已轉(zhuǎn)院或失訪；而臨床診斷的結(jié)核病患兒中，最終接受抗結(jié)核治療的比例僅為44%[8，9]。因此，尋找快速診斷兒童肺結(jié)核的檢測方法具有迫切性。

Xpert MTB/RIF檢測是一種巢式PCR體外診斷技術(shù)，其通過檢測結(jié)合分枝桿菌上rpoB基因及利福平耐藥相關(guān)81bp的核心區(qū)間，從而實現(xiàn)對結(jié)合分枝桿菌感染情況及其利福平耐藥情況的診斷，該檢測操作簡便，全程自動化，且在120 min內(nèi)完成[10，11]。巢式PCR的使用使診斷敏感度得以顯著提高，并在極大程度上減少了非特異性擴增。鑒于絕大部分結(jié)合分枝桿菌在對利福平耐藥的同時亦對異煙肼耐藥，故在某種程度上檢測利福平耐藥情況即可反映結(jié)合分枝桿菌多藥耐藥情況[12]。近年來，Xpert MTB/RIF檢測在各臨床標本中有著廣泛應(yīng)用，應(yīng)用價值得到較多研究證實。Pimkina等[13]報道Xpert MTB/RIF對培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核診斷的敏感度為93.7%，特異度為91.7%。路麗蘋等[14]研究顯示，Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核病的敏感度高于涂片法，且對利福平耐藥檢測的敏感度、特異度均超過90%。Xpert MTB/RIF檢測已成為WHO推薦的肺結(jié)核診斷技術(shù)，但其在兒童肺結(jié)核診斷上尚缺乏有效研究證實。

本研究采用Xpert MTB/RIF檢測經(jīng)肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)證實的肺結(jié)核患兒，靈敏度為96.00%。但羅氏培養(yǎng)顯示的95例陰性標本中，用Xpert MTB/RIF檢測的陽性率為52.63%，可見Xpert MTB/RIF檢測提高了兒童肺結(jié)核的診斷能力。在檢測利福平耐藥結(jié)果上，以比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的敏感度為100.00%，特異度為95.45%。敏感度高達100.00%可能與納入病例數(shù)較少有關(guān)，該檢測系統(tǒng)是根據(jù)rpoB耐藥決定區(qū)81bp范圍內(nèi)序列對利福平耐藥相關(guān)ropB基因進行檢測的，設(shè)計了5對探針熒光基因，并未覆蓋全部突出位點。國外學(xué)者[15]采用Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)對肺結(jié)核兒童(年齡<15歲)進行檢測，結(jié)果顯示靈敏度為74.0%，明顯低于FIND基金會[16]報道的成人肺結(jié)核的98.2%。本研究Xpert MTB/RIF對肺結(jié)核患兒肺泡灌洗液檢測敏感度僅為61.67%，低于上述研究，可能與采集標本含菌少、合格率低有關(guān)。本研究中有3個標本首次檢查時顯示陰性結(jié)果，可能與標本處理質(zhì)量差或試劑盒存在質(zhì)量問題等使得DNA擴增受限有關(guān)。此外，Xpert MTB/RIF檢測在120 min內(nèi)完成，全程自動化、封閉化，不僅快速，且安全性高。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測在兒童肺結(jié)核診斷及利福平耐藥判斷上效果優(yōu)于羅氏培養(yǎng)，能夠為早期診療提供重要幫助，且具有簡捷、快速、陽性率高等特點，適合基層醫(yī)院推廣，應(yīng)用前景廣闊。