體外藥敏實驗對卵巢癌個體化化療的療效分析

蘇 丹，何文靜，劉 屹，崔慢慢，謝 蘭，岳 軍

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院婦產科，四川 成都 610072)

在影響女性生存的女性腫瘤中，卵巢癌一直占據首位，而眾所周知，化療是主要的治療手段之一。因為瘤的異質性特征，即使是組織類型和分化程度相同的腫瘤，對相同化療藥物的敏感程度也不盡相同，是否會耐藥也無法預知。因此，化療藥物敏感和耐藥試驗應運而生。 其中，三磷酸腺苷法腫瘤化學敏感檢測(ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA)法被研究得越來越多[1]。 本研究擬采用ATP-TCA藥敏試驗法檢測卵巢癌患者腫瘤組織，并與患者化療效果一起分析，探討兩者的相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年1月至2017年12月在四川省人民醫院婦產科診斷為原發性上皮性卵巢癌并行手術治療的患者，收集其手術切除的新鮮腫瘤組織行體外藥敏試驗，共75例，均獲患者知情同意。另選擇98例手術后未行藥敏試驗但在我科化療的患者作為對照組。兩組患者基本情況見表1。

表1 兩組患者基本情況比較

1.2 材料生物熒光藥物敏感性檢測試劑盒(ATP-chemiluminescence method，ATP-TCA試劑盒)，購自于湖州海創生物科技有限公司。 進行實驗的化療藥物如下：紫杉醇(taxol)，購自于太極制藥公司；卡鉑(carboplatin)，購自于齊魯制藥公司；順鉑(cisplatin)，購自于江蘇豪森藥業公司；環磷酰胺(cyclophosphamide)，購自于浙江海正藥業公司；多西他賽(docetaxel)，購自于江蘇恒瑞醫藥公司；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，購自于天津金耀公司公司；吉西他濱(gemcitabine)，購自于法國禮來公司；拓撲替康(topotecan)，購自于葛蘭素史克公司。根據血漿峰值濃度(plasma peak concentration，PPC)確定上述藥物試驗濃度，分別為：環磷酰胺：3 μg/ml、順鉑：6.3 μg/ml、卡鉑：25 μg/ml、多西他賽：10 μg/ml、紫杉醇：13.8 μg/ml、5-氟尿嘧啶：0.9 μg/ml、拓撲替康：0.14 μg/ml、吉西他濱：25 μg/ml。

1.3 方法ATP-TCA操作步驟根據試劑盒標準流程進行：將手術切除的新鮮腫瘤組織反復沖洗，除掉血凝塊及壞死組織等，剪碎、離心、消化后制成濃度為(1～3)×105/ml的細胞懸液。將其加入96孔細胞培養板中，置細胞培養箱中孵育4小時后，加入八種化療藥物。在培養箱中繼續孵育5～7天，然后加入ATP提取液，混勻后室溫下靜置15分鐘，依次取0.05 ml混合液置熒光分析儀檢測。每個藥物設5個濃度梯度，依次為2倍PPC、單倍PPC、1/2倍PPC、1/4倍PPC及1/8倍PPC，同時設空白孔(不含腫瘤細胞及藥物)及對照孔(含腫瘤細胞但不加藥物)。化療藥物的抑制率=(1-ATP試驗組/ATP對照組)×100%。抑制率≥70%為高度敏感；50%～70%為中度敏感；30%～50%為低度敏感；<30%為耐藥；當抑制率≥50%時可以推薦臨床使用。

1.4 臨床應用與評價根據藥敏結果從高至低順序，選擇敏感性高的化療方案進行化療6～8個周期，化療結束后根據婦科三合診、腫瘤標記物(如CA125等)、B超、CT等情況綜合判定局部腫瘤變化情況。療效評定按世界衛生組織(WHO)實體瘤的評定標準[2]，完全緩解(CR)：腫瘤病灶完全消失；部分緩解(PR)：腫瘤病灶縮小50%；腫瘤穩定(SD)：腫瘤病灶無明顯變化；腫瘤進展(PD)：腫瘤病灶較前增大。以CR和PR為有效，以SD和PD為無效。隨訪時間終點為2018年4月，分析指標包括無進展生存期(PFS)、總生存期(OS)及3年生存率。

1.5 統計學方法應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。定量資料均以均數±標準差表示，組間比較采用χ2檢驗，用Kaplan-Meier法進行生存分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATP-TCA法結果在收集的75例患者中，腫瘤生長抑制率試驗結果見圖1和表2。根據上述藥敏試驗結果，可以得出上述常見化療藥物中高度敏感組和中度敏感組比例分別為45.2%和16.7%。在單倍PPC時將不同化療藥物的腫瘤抑制率進行統計，并按從高到低的順序進行排列，見表3。本試驗中環磷酰胺+順鉑、5-氟尿嘧啶+順鉑及拓撲替康+卡鉑等3組化療藥對體外卵巢癌細胞生長無效，而其余5組化療藥則具有抑制作用。將不同化療藥物中、 高度敏感組例數占總例數(n=75)百分比進行排列，結果見表2第3、4行。結果顯示：紫杉醇+卡鉑、紫杉醇+順鉑、多西他賽+卡鉑的中、高度敏感組比例最高，其次是吉西他濱+順鉑和伊立替康+卡鉑組，然而環磷酰胺+順鉑、5-氟尿嘧啶+順鉑和拓撲替康+卡鉑低度敏感比例低于50%，不推薦臨床使用。

圖1 8組化療藥物對75例卵巢癌標本的抑制例數分布圖

表2 8種化療藥物對75例卵巢癌標本的抑制例數 (n)

表3 ATP-TCA法檢測的藥物中+高敏感組所占比例

2.2 近期療效評價由表4可見，近期臨床治療有效率77.33%，對照組則為72.45%，兩組比較差異有統計學意義(χ2=15.213，P< 0.05)，說明根據藥敏試驗選擇治療方案可獲得較高近期治療有效率。

表4 近期臨床治療效果

2.3 遠期療效比較結果顯示，藥敏組的PFS與OS均較對照組明顯延長；藥敏組患者3年生存率高于對照組，差異有統計學意義(P< 0.05)。見表5及圖2。

表5 兩組患者生存期與生存率比較

圖2 兩組患者PFS期與OS期比較

3 討論

卵巢癌是影響我國女性生存的第二大惡性腫瘤，隨著診治方式的不斷進步，手術治療聯合化療已能大大提高卵巢癌患者的生存率，但仍有很大一部分患者在術后3年內復發[3]。化療是卵巢癌綜合治療中的主要組成部分之一，但根據標準化療方案給患者提供治療時，由于患者體內藥物代謝酶的遺傳性及腫瘤的異質性不同，使患者個體對不同化療藥物的敏感性存在差異，甚至部分患者不能獲得臨床緩解，而另一部分患者可能因為嚴重的毒副反應不能完成療程[4]。化療藥物敏感和耐藥試驗(chemotherapy sensitivity and resistance assays，CSRA)因此產生。美國國家綜合癌癥網(NCCN)在近期的卵巢癌治療指南中指出，腫瘤中心有多種化療藥物時，如果條件允許，可參照腫瘤藥敏試驗結果選擇具體化療方案[5]。

根據試驗技術的不同，體外腫瘤藥敏試驗可分為四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法、 ATP-TCA法、 ChemoFx法、極端耐藥試驗法、細胞毒性差異染色方法、軟瓊脂克隆形成試驗、立體組織培養法等[6]。MTT 實驗室使用較多，但結果與臨床一致性差。ATP-TCA法敏感性高，所需腫瘤細胞數極少，最低僅需20～250個細胞，并且其簡便、靈敏度高、重復性好、臨床符合率較高，從而成為關注的熱點，且已有相關試劑盒上市，可以在臨床上廣泛推廣。但該法不能區別非腫瘤細胞與腫瘤細胞，可能導致誤差，因此收集到的腫瘤組織最好經過修剪，去除血管、壞死組織等預處理[7]。ChemoFx檢測法則可以排除非腫瘤細胞的影響，但此試驗需要培養腫瘤細胞2～3周，耗時較長[8]。實際上，腫瘤在體內生長還依賴于周圍的血液供應及細胞間的相互作用，因此產生了立體組織培養法[9]。其將單層細胞培養改為組織塊或多細胞球體培養，可以更好地模擬實體瘤體內生長環境，更接近于臨床。但該種方法技術難度大，重復性和穩定性還有待進一步提高。因此從可重復性及經濟實效性等出發，本實驗選擇了ATP-TCA法。

本研究采用ATP-TCA法對75例卵巢上皮性癌患者的腫瘤細胞進行藥敏試驗，而本試驗藥敏組和對照組的治療近期有效率分別為77.33%及 72.45%，PFS分別是20.72月及18.84月，中位生存期分別是32.30月及29.03月，3年生存率分別是54%及46%，結果顯示根據化療藥敏試驗選擇的化療方案可獲得較高的臨床有效率。崔穎等[10]收集88例卵巢癌進行ATP-TCA體外藥敏試驗，并設立對照組，結果顯示藥敏組患者的治療近期有效率高于對照組，其值分別為85.23%及68.75%。而本實驗試驗組和對照組的治療近期有效率分別為77.33%及 72.45%，與上述報道結果相近。

目前，國際婦產科聯盟(FIGO)和 NCCN等多家國際權威機構和大多數婦科腫瘤中心將紫杉醇和鉑類(TP)聯合方案確定為卵巢上皮性癌的標準一線化療方案[5]。本試驗結果也提示PPC下紫杉醇+卡鉑的腫瘤生長抑制率最高。Zhang等[7]的體外藥敏結果顯示：單藥方案中敏感性最強的為紫杉醇(82.5%)，卡鉑(58.8%)次之；聯合用藥敏感性較單藥方案增加。而本實驗結果提示化療敏感性由高到低依次為：紫杉醇+卡鉑>紫杉醇+順鉑>多西他賽+卡鉑>吉西他濱+順鉑>伊立替康+卡鉑>環磷酰胺+順鉑>5-氟尿嘧啶+順鉑>拓撲替康+卡鉑，兩個試驗結果相近。因此，藥敏試驗結果也進一步證實紫杉醇+卡鉑為卵巢上皮性腫瘤的一線化療方案。另外，Fruehauf等[11]認為，即使證實為卵巢上皮性腫瘤患者，也可以對其進行紫杉醇、鉑類等一線藥物的體外藥敏實驗來篩選出可能耐藥者。腫瘤學家可能據此略過這些不敏感的藥物選用其它的治療方案，從而使耐藥患者免于不必要的化療及由此帶來的副作用及金錢浪費，為患者爭取寶貴的治療時間，最終使患者從中獲益。究其原因可能在于如果腫瘤細胞在體外實驗這種盡量使藥效達到最佳的環境中已經表現出完全耐藥，那么體內環境中由于各種因素的影響可能降低化療藥物療效，如腫瘤過大導致血供不良、藥物代謝酶降解藥物等，甚至可能治療失敗。因此認為體外藥敏試驗的陰性預測值，即對治療失敗或不敏感的預測準確性更高。

因此，體外藥物敏感試驗可以協助腫瘤醫生提前了解不同患者對不同化療藥物的敏感性，并據此篩選出對患者更有益的藥物，制定出個體化的化療方案，減少時間和金錢的浪費，提高患者生存率。但是體外實驗并不能完全模擬出體內環境，因此體外實驗與實際臨床效果間的關系，仍需要進行大量的研究。