奧美拉唑對小鼠精原干細胞生長與增殖分化的影響

張奎原，南 濤，張 虎，孫澤坤，楊薛楓，孫兆林，胡建新

(1.貴州醫科大學 貴州 貴陽 550000；2.貴州省人民醫院泌尿外科，貴州 貴陽 550000)

精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是一種定向分化為成熟精子的干細胞[1～3]。然而，如何促進小鼠SSCs生長、增殖與分化作用尚不明確。近年來，男性精子總量及精子質量較前明顯下降。男性少、弱精子癥及無精癥發病率明顯呈增高趨勢，男性不育率已占不育夫婦的20% 以上[4～6]。有相關研究表明胃酸相關癥狀藥物治療對活動精子總數和濃度有影響，提示抑酸藥物使用與男性不育者精子質量較差相關[7]，但具體作用的分子機制尚不明確。2015年12月至2019年3月本研究探討抑酸藥物對體外培養SSCs增殖與分化的影響，探討其對男性生殖能力的不良影響。

1 材料與方法

1.1 材料5～7日齡昆明雄性小白鼠30只購置于實驗動物中心(貴州醫科大學)；透明質酸酶、胰蛋白酶、胎牛血清、Ⅳ型膠原酶、DMEM/F-12、DMEM、雙抗濃儲液(1000×P/S)：1×105IU/ml、青霉素鈉，1×105μg/ml 硫酸鏈霉素、TrisHCI、kit(FITC抗體：免疫熒光)、a6-整合素(FITC抗體：疫熒光)等(sigma公司)；奧美拉唑膠囊(20 mg)，購自浙江金華康恩貝公司；Trizol：碧云天生物；反轉錄試劑盒，PCR Mix 試劑盒：Fermentas。DNA Marker DL2，000：5×DNA上樣緩沖液：美國ProMab，SJ-TD20085201。TaKaRa D501 A，PCR儀，ABI公司；水平電泳槽(北京儀器公司)；離心機、JY-SPC、DG-Ⅲ電泳儀、 SIGMA，1-13(北京鼎國公司)；成像系統等。

1.2 方法

1.2.1小鼠SSCs體外分離、培養 ①酒精(75%)浸泡昆明小鼠15 min。②分離出小鼠雙側睪丸組織，置于培養皿中(含有PBS)，PBS清洗2～3次。③充分去除睪丸外層組織，并將睪丸組織移入10 ml離心管。④加入10倍體積PBS，反復充分吹打(進一步祛除白膜)，靜置，待沉淀后棄上清。⑤加入膠原酶Ⅳ(10倍體積)，置于37 ℃恒溫箱，放置10 min。⑥加入5～10 mlPBS，輕輕吹打1～2 min，600r離心5 min，棄上清(重復2～3次)。⑦加入胰蛋白酶(5倍體積)，置于37 ℃水浴鍋，消化10 min，并不斷吹打(充分消化)。⑧加入等體積DMEM，400目細胞篩，濾過細胞(祛除雜質)。⑨濾液16 ℃1000r 6 min，棄上清，洗滌2～3次。⑩計數5×105個/ml，接種于培養基。6～8 h后，采用差速貼壁法分離小鼠 SSCs和Sertoli。

1.2.2小鼠SSCs生長情況 共培養24、72、120、192及240 h后，用400×顯微鏡分別觀察二組細胞生長狀態、數目的變化。

1.2.3小鼠SSCs的鑒定 ①加入PBS液，浸洗2次，5 min/次。②4% PFA(多聚甲醛)固定細胞20 min，PBS液浸洗3次，5 min/次。③0.1 TWeen-20(PBST)10 min，透化細胞，PBS洗一次，5 min/次。④加入5%BSA的PBST，封閉45 min。⑤加入一抗(1∶200稀釋封閉液，置于4 ℃培養箱過夜)。⑥加入二抗稀釋液，細胞洗滌3次，5 min/次。⑦加入二抗(1∶200稀釋于二抗稀釋液中)，37 ℃，60 min。⑧PBS洗3次，5 min/次。加入DAPI 3～5 min，PBS洗3次，5 min/次。⑨置于顯微鏡(免疫熒光)下檢測。

1.2.4小鼠SSCs生長增殖檢測 取實驗組及對照組生長狀態良好的兩組細胞，調控細胞濃度為(5×104/ml)，并種植于96孔板中，190 μl/孔，分別孵育24 h后，加入查爾酮類衍生物C10，并設置5個復孔，分別共培養24、72、120、192、240 h后，每孔加入20 μl MTT，孵育6～8 h后離心，棄上清液，然后加入150 μl DMSO，室溫震蕩15分鐘，并置于490 nm光激發下用酶標儀測吸光度(OD值)。

1.2.5小鼠精原干細胞基因水平檢測 運用PCR技術，檢測實驗組及對照組SSCs 基因水平。

1.2.6RNA提取 ①樣本中加入0.8 ml Trizol，吹打使細胞充分溶解。②室溫下靜置5～10 min，后添加氯仿(0.2倍體積)，需震動15秒，后在2～8 ℃下離心機12，000×g離心15 min。③將水樣層樣本轉移至試管中，加入異丙醇(0.5倍體積)，二者充分混勻后置于-20 ℃冰箱10～15 min，后在2～8 ℃下離心機12，000×g離心10 min。④去上層懸液，將RNA沉淀用1 ml 75%乙醇清洗，在震蕩器上混勻，置于2～8 ℃離心機7，500×g，5 min，保留下層沉淀。5.待RNA沉淀適度干燥后，加入無RNase的水(使RNA溶解)。⑥室溫下離心機2000 rpm離心20 sec。⑦將獲得的RNA溶液，保存于-80 ℃待用。

1.2.7PCR擴增程序 獲得所需樣品。

1.2.8瓊脂糖凝膠電泳檢測 上樣：須預電泳5 min(上樣前)，后加入上樣孔。電泳：5～6 V/cm電壓2～2.5 h，使溴酚蘭指示劑進入凝膠(2～3 cm即可)。紫外透射光下，觀察結果并拍照。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0軟件分析數據，重復測量數據比較采用方差分析及LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠SSCs生長狀態觀察對照組精原干細胞 小鼠SSCs接種12～24 h后，細胞開始黏附、分裂增殖，呈體積中等、圓形、大小均一。細胞之間見未斷開的間橋，邊緣呈透明狀。隨著共培養時間的延長，精原干細胞生長、增殖逐漸明顯，并在接種后第240 h形成數百個細胞的細胞團，細胞總數達高峰。實驗組小鼠SSCs 實驗組SSCS相對較對照組細胞貼壁慢，并且較為散亂，細胞之間未見明顯相互連接。培養240 h時，可見小鼠SSCs有增殖，但細胞的數目、細胞相互連接仍不明顯。如圖1。

圖1 各組 SSCs生長形態檢測(顯微鏡檢測，×400) a：對照組培養24 h；b：對照組培養240 h；c：實驗組培養24 h；d 實驗組培養240 h

2.2 實驗組與對照組精原干細胞檢測結果培養240 h后分別運用免疫熒光顯微鏡(400倍)檢測實驗組與對照組SSCs：兩組小鼠SSCs大小、生長狀態相似，但實驗組小鼠SSCs總數明顯低于對照組。如圖2。

圖2 各組細胞檢測結果(免疫熒光檢測，×400) a：實驗組；b：對照組

2.3 小鼠SSCs生長、增殖檢測隨共培養時間的延長，對照組小鼠SSCs OD值，逐漸增高，相對實驗組小鼠SSCs，OD值則增高不明顯。不同時間點內，二組小鼠SSCs OD值結果性差異有統計學意義(P< 0.01)。見表1。

培養時間(h)實驗組(n=30)對照組(n=30)240.122±0.031?0.174±0.027720.165±0.016?0.273±0.0561200.217±0.029?0.324±0.0301920.345±0.042?0.599±0.0472400.400±0.082?1.052±0.097

* 與對照組比較，P< 0.01

2.4 小鼠SSCs生長、增殖基因(PCR)檢測共培養240 h時，提取小鼠實驗組SSCs及對照組SSCs，運用PCR技術(聚合酶鏈反應)，分別檢測兩組小乳鼠SSCs DNA。可見對照組小鼠SSCsDNA量明顯高于實驗組小鼠SSCs，見圖3。

圖3 實驗組與對照組PCR結果(Marker自上而下為750bp、500bp、250bp、100bp)a:實驗組：b：對照組

3 討論

小鼠睪丸SSCs是定向分化為精子的起始細胞，受其周圍的內環境因素影響較大。影響精子總數及質量的原因有很多種，尤其是藥物對男性生育能力的不良作用，受到其的種類、劑量、藥代動力學、療程、患者年齡等諸多因素的影響[8～10]。一般來說，藥物的劑量越大、藥代動力學越長、療程越長、年齡越小，對男性生育功能的損害就越嚴重，從而造成精子總數量及精子質量的下降[11]。本研究發現，在體外培養的精原干細胞培養液中添加質子泵抑制藥奧美拉唑后，SSCs的生長變慢，增殖與分化也受到了不良影響。前期實驗表明：SSCs貼壁速度較慢，為12～24 h，潛伏期為24～96 h，故選擇在培養24、72、120、192、240 h分別用顯微鏡直視下觀察兩組SSCs在不同時間點SSCs生長形態及數目；結果表明，培養240 h時，實驗組細胞數目明顯低于對照組，故選擇培養240 h時進行PCR技術檢測。研究提示質子泵抑酸藥對SSCs產生了不良影響，很可能造成男性不育。另有研究表明，抑酸藥物對活動精子總數和濃度有影響，與男性不育者精子質量較差相關，以及與精子濃度降低相關。并假設抑酸藥物降低小腸吸收維生素B的可得性，從而造成一碳物質代謝紊亂，并對精子形成造成不利影響[12]。但具體作用機制尚不清楚。Kadam等[13]研究發現，色域解旋酶/ATP酶DNA結合蛋白(Chd1)是一種新的SSCs存活和自我更新調節因子，并用高通量的小RNA測序揭示Chd1控制的microRNA(MiR)表達譜，結果表明，在SSCs中，124 miR轉錄本的表達受到Chd1的不同調控。KEGG通路分析表明，Chd1抑制的差異表達miRs蛋白，在干細胞多能性和增殖相關的通路呈現中明顯富集的作用。并證明了上調miRs之一miR-486控制著SSCs基因的表達和生長特性。即Chd1、miR-486和MMP 2協同調控SSCs基因表達和生長特性。我們猜想抑酸藥物(奧美拉唑)是通過作用于色域解旋酶/ATP酶DNA結合蛋白(Chd1l)，抑制調控miR-486和MMP 2，從而抑制SSCs生長與增值分化。Chd1l-miR-486-MMP 2是調控SSCs基因表達和生長特性的一個新的調節軸。我們通過向DMEM/F12完全培養液中添加中抑酸藥物藥后培養SSCs，培養結果顯示SSCs生長與增殖分化明顯受到抑制，這可能與抑酸藥物中的質子泵抑制劑抑制了SSCsChd1l-miR-486-MMP 2靶向軸有關將，也將加快人們對這一領域的深入認識，也為治療男性不育提供一種新的治療方法。