黃野螟蛻皮激素受體基因HvEcR的鑒定及表達分析

呂子豪，李治興，林 同

(華南農業大學 林學與風景園林學院，廣州 510642)

黃野螟(HeortiavitessoidesMoore)是一種寡食性的食葉害蟲[1-2]，其寄主為國家二級重點保護野生植物土沉香(AquilariasinensisSprenger)[3]。該蟲生長季節蟲口爆發迅速，數日便可把葉片吃光，造成枯苗、死苗，嚴重影響植株生長，制約結香的產量與質量，造成極大的經濟損失[1,4]。近年來，國內外關于黃野螟的研究大多集中在生物學特性、行為學、農藥防治技術方面，關于昆蟲生長調節劑防治及其分子方面的研究鮮見報道。

蛻皮激素核受體EcR是核受體超家族成員[5]，最早在果蠅(Drosophilamelanogaster)中得到鑒定[6]，具有蛻皮激素(Ecdysteroid hormones, EH) 配體專一性[7]， EH通過其進行信號轉導。高20E濃度條件下，EcR與另一個蛻皮激素受體——超氣門蛋白(Ultraspiracle，USP)會被誘導形成異二聚體，進而激活一系列早期應答基因與晚期基因的表達[8-11]。因此，EcR在昆蟲蛻皮和變態過程中具有重要作用。

蛻皮是由數種激素協同調控的昆蟲生長發育所必需的復雜生命過程[12]，蛻皮激素與保幼激素(Juvenile hormone，JH)的協同作用在此過程中發揮關鍵作用。蛻皮激素需經過一系列羥基化作用，被激活為具有更高活性的20-羥基蛻皮酮(20E)才能發揮作用[13-16]。當JH滴度較高時，20E引起昆蟲脫皮，當JH滴度較低，20E誘導昆蟲進入下一齡期或發生變態[17]。EcR接受20E信號后，一系列蛻皮級聯反應將被啟動。因此，研究昆蟲的EcR基因具有相當的分子生物學意義。本研究利用RT-qPCR技術檢測HvEcR基因在黃野螟各發育階段及幼蟲組織中的轉錄水平，同時明確HvEcR的表達量對20E脅迫的響應，豐富了EcR的分子生物學信息。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

于廣州天鹿湖森林公園采集蟲卵及1至5齡試蟲，飼喂新鮮土沉香葉片，室內飼養條件為：溫度26 ℃，相對濕度75%，光期14 h，暗期10 h。20E試劑購自上海源葉生物科技有限公司。總RNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ)購自OMEGA公司；反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)及實時熒光定量試劑盒(TB GreenTMPremix Ex TaqTM)均購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 野外采集工作后，立即用液氮處理卵(3片)及各蟲態幼蟲(各5頭)，存放于 -80 ℃冰箱中；其余個體飼養至老熟幼蟲時，轉移到鋪有2 cm厚沙土(相對濕度為50%)的塑料養蟲盒中，待其化蛹羽化后，用同樣方法收集蛹及成蟲(各5頭)。選取40頭健康的4～5齡幼蟲，經清洗、消毒后，在臘盤上解剖，獲取幼蟲體壁、頭、脂肪體、中腸、馬氏管等組織樣品，立即置于無菌去酶的凍存管中，經液氮速凍后，存放于 -80 ℃冰箱。

1.2.2 蛻皮激素脅迫處理 先用DMSO將20E稀釋至10 mg/mL，存放于-20℃冰箱，備用。試驗時用1×PBS將20E稀釋至30 ng/ μL和150 ng/ μL 2個質量濃度。采用注射法對4齡幼蟲進行蛻皮激素脅迫，用φ=75%酒精擦拭蟲體，蟲體置于冰上麻醉后，從腹部側面注射。每頭蟲子注射1 μL液體，對照組為等量稀釋的DMSO。注射后繼續用沉香葉片飼養于人工氣候箱中，分別于注射后24、48、72 h取樣。

1.2.3 RNA提取與cDNA合成 嚴格按照E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ試劑盒說明書提取各樣本總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳以及微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)檢測合格后，置于 -80 ℃冰箱保存，備用。嚴格按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書，將總RNA(0.8 μg)逆轉錄為第一鏈cDNA，稀釋20倍后，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4 基因表達 從黃野螟轉錄組文庫篩選出具有完整ORF框的EcR基因序列，用實時熒光定量PCR反應(RT-qPCR)檢測其表達量，所用內參基因為β-actin；所用目的基因引物為：Forward:5′-GCCAACCAGCAGTTCCTCATCG-3′和Reverse:5′-CGTCCTCTTCCTCCGTTGATTGC-3′；陰性對照為無菌超純水處理；反應體系包括cDNA模板 20 μL，TB Green Premix ExTaq 10.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃解鏈10 s，60 ℃延伸20 s，共進行40個循環。每個樣本設置3個技術重復，根據反應結束后的Ct值，使用2-△△Ct相對定量法計算HvEcR相對表達量。用Excel進行統計分析，采用SPSS 18.0進行單因素方差分析與鄧肯分析。

1.3 生物信息學分析、同源比對及系統發育樹構建

在multalin網站(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)進行氨基酸序列同源比對，采用ExPASy-ProtPram軟件進行蛋白質理化性質預測，采用PSORT在線工具(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)預測亞細胞定位，采用NPS在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4. pl)預測蛋白質二級結構，采用SWISS-MODEL在線工具(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/yrSsgx/models/)模擬EcR蛋白高級結構，采用ClustalX軟件和MEGA 5.0軟件構建系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 HvEcR基因序列及蛋白高級結構分析

從黃野螟轉錄組文庫中篩選出具有完整ORF框的目的片段，將其命名為HvEcR(登錄號：MH588318)，序列全長1 734 bp，包含1 638 bp長的ORF框，共編碼545個氨基酸。使用ProtPram軟件對HvEcR的理化性質進行分析，結果表明，該蛋白的分子質量為61.70 ku，理論等電點為5.89，脂肪指數為73.71，不穩定性指數為68.47，為不穩定蛋白，總平均疏水性為 -0.442，為親水性蛋白。NetPhos 3.1軟件的預測結果為：HvEcR含絲氨酸位點16個，蘇氨酸和酪氨酸位點各2個(得分大于0.9)。

Signal P 4.1軟件預測結果為：HvEcR不存在信號肽，為非分泌蛋白。根據PSORTII軟件預測的亞細胞定位結果可知，HvEcR位于線粒體的可能性最大，為60.9%，其次是細胞核和細胞質，分別有26.1%和8.7%的可能性，位于細胞骨架可能性則較低，僅為4.3%。TMpred軟件跨膜區分析結果為，無得分大于500的跨膜螺旋。TMHMM 軟件基于隱馬爾可夫模型(hidden Markov model)的跨膜螺旋預測結果為，HvEcR被標記在外部，不含跨膜螺旋。蛋白的疏水性越強，其疏水區為跨膜區的可能性就越大，HvEcR無跨膜區，符合上文的親水性預測結果。

Conserved Domains軟件分析表明(圖1)，HvEcR含有EcR家族典型的DNA結合域(DNA binding domain，DBD)和配體結合域(Ligand binding domain，LBD)。SMART軟件分析顯示，HvEcR由6個功能結構域組成，分別為兩段鋅指結構域(zinc finger，ZF)，3個低密度復雜區(low complexity region，LCR)和1個配體結合域(圖2)。這兩個軟件的分析結果進一步證明篩選出的HvEcR基因與其他昆蟲的EcR一樣，均為核受體家族成員。經SOPMA和SWISS-MODEL軟件進行蛋白質結構預測和建模，結果顯示，HvEcR編碼的蛋白主要由α-螺旋與無規則螺旋組成，它們分別占36.15%和48.62% (圖3)。

圖1HvEcR蛋白序列的保守結構域預測Fig.1 Putative conserved domain of HvEcR

低密度復雜區以大括號標注；鋅指結構域以陰影標注；配體結構域以方框標注；終止密碼子TAG以星號標注 LCRs are marked in braces; ZFs are marked with shadow; LBD is marked with boxes; the termination codon is marked with asterisk

圖2 黃野螟EcR基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofEcRgene fromH.vitessoides

圖中彩虹條表示從N端到C端的氨基酸 The rainbow bar represents the amino acid from N-terminal to C-terminal

圖3HvEcR的三維結構
Fig.3 Three-dimensional structure ofHvEcR

2.2 同源比對及系統發育樹

在NCBI網站上進行同源搜索，用multalin軟件進行同源比對，結果表明，HvEcR序列與三化螟和二化螟的同源性最高，分別高達96%和92%(圖4)。基于鱗翅目12種昆蟲的EcR氨基酸序列，采用NJ法構建系統發育樹，結果表明，黃野螟與水稻三化螟和二化螟的親緣關系最近，結果與同源性比對一致(圖5)。

2.3 黃野螟HvEcR基因的時空動態表達

黃野螟發育階段表達譜顯示(圖6)，以HvEcR在卵期的表達量為對照，HvEcR的轉錄水平在各發育時期差異顯著，在成蟲時達到峰值，為對照的12倍；其次是5齡幼蟲時，為對照的 5.68倍。在3齡幼蟲時表達量最低，僅為卵的 0.22。

由圖7可知，HvEcR在黃野螟幼蟲各組織中均有表達，在體壁中表達量最低，設為對照；在脂肪體中表達較高，為對照的4.54倍。其次，HvEcR在頭與馬氏管中也有較高表達，分別為對照的2.85倍和2.49倍。

用質量濃度分別為30 ng/μL、150 ng/μL的蛻皮激素溶液和等量稀釋的DMSO溶液處理黃野螟4齡幼蟲，于處理后24 h、48 h和72 h檢測HvEcR基因的表達情況。RT-qPCR結果顯示(圖8)，在兩種質量濃度處理24 h后，均能引起HvEcR基因的表達量上調。在注射質量濃度為150 ng/μL，處理時間為48 h時，HvEcR表達量上調最為明顯，為對照的4.10倍。結果表明，HvEcR基因的表達受20E調控。

3 討 論

本研究鑒定1條黃野螟HvEcR基因，其編碼的氨基酸含2個鋅指結構域、1個配體結構域和3個低密度復雜區等6個保守結構域，具有與其他昆蟲EcR相似的典型的基因家族特征。HvEcR與其他鱗翅目昆蟲EcR的親緣關系較近，在進化過程中十分保守。

作為蛻皮激素的受體，HvEcR的表達水平可能與20E滴度密切相關[18]，本研究結果顯示，黃野螟HvEcR的表達水平可能受20E的誘導調節(圖8)。蛻皮激素與保幼激素共同參與每一齡幼蟲的組織重建和表皮形成[19]。RT-qPCR結果顯示，HvEcR在卵期及1～4齡幼蟲時表達量較低且相對穩定，到5齡時達到小高峰，到蛹期又降低，與昆蟲不同發育時期體內蛻皮激素的變化趨勢一致[20-21]。因此，推測HvEcR對黃野螟末齡幼蟲的發育起重要作用，可能與組織重建和預蛹發育有關[22]。蛻皮激素參與昆蟲成蟲的卵子發生和生殖過程[17]，在黃野螟成蟲體內，HvEcR有高表達，推測作為蛻皮激素受體的EcR也與該過程有關[23]。

圖5 基于昆蟲EcR氨基酸序列構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic relationships of insects based on amino acids of EcR

EcR存在昆蟲不同組織中，參與20E介導下的組織重建，如EcR在埃及伊蚊 (Aedesaegypti)幼蟲中參與組織溶解過程，在家蠶和水稻二化螟幼蟲脂肪體中特異性表達，在果繩中參與神經元重建[24-27]。對黃野螟幼蟲不同組織的HvEcR轉錄水平進行檢測，發現其主要在脂肪體中表達，為對照的4.54倍。脂肪體是昆蟲重要的能量貯備中心，且在物質代謝中扮演關鍵角色，作為蛻皮激素受體，HvEcR可能與黃野螟營養儲存及能量代謝有關。除在脂肪體表達外，HvEcR在馬氏管和頭部中也有較高表達，但其功能需進一步澄清。

數據為“平均數±標準差”；柱上字母代表差異顯著(P< 0.05)；圖7、圖8同 Data in the figure are represented as mean ± SD；different letters mean significant difference on the bar (P<0.05). The same as Fig.7 and 8;E.卵 Egg；L1、L2、L3、L4、L5.1～5齡幼蟲 Larve stage 1-5；P.蛹 Pupal；A.成蟲 Adult

圖6HvEcR基因在黃野螟各發育時期的表達
Fig.6 The expression level ofHvEcRindevelopmental stages ofH.vitessoides

IN.體壁 Integument；HE.頭 Head；FA.脂肪體 Fat body；MG.中腸 Midgut；MT.馬氏管 Malpighian tubule

圖7HvEcR基因在黃野螟幼蟲中的表達
Fig.7 The expression level ofHvEcRin the larvae ofH.vitessoides

研究昆蟲EcR的分子機制，不僅有助于深入理解昆蟲的蛻皮行為，還能為害蟲防控提供新思路。基于本試驗對黃野螟HvEcR功能的初步研究，后續還將通過RNA干擾技術及相關生理生化試驗，進一步研究該基因的功能，為開發環境友好型的EcR靶標殺蟲劑提供更多的分子生物學參考。

圖8 不同時間不同質量濃度的20E處理對HvEcR基因表達的影響Fig.8 Expression profile of HvEcR at differrent time and different 20E mass concentration