異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性風險及解毒酶活力分析

沈登榮,何 超,袁盛勇,田學軍,李 珣,張宏瑞

(1. 紅河學院 生命科學與技術學院,云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室,云南蒙自 661199; 2. 云南農業大學 植物保護學院,昆明 650201)

異遲眼蕈蚊(Bradysiadifformis)是世界性的農業和林業害蟲，主要分布在亞洲、歐洲、北美洲、南美洲和非洲等地區[1-2]。2009年中國首次報道異遲眼蕈蚊在云南食用菌的危害，同時該蟲也是云南食用菌、野生菌害蟲的優勢種類[3-4]。異遲眼蕈蚊以幼蟲取食菌絲體造成食用菌產量的下降，因其發育歷期短、繁殖力強等特點，目前在食用菌生產中主要采用化學藥劑對其進行防治，其中擬除蟲菊酯類殺蟲劑是食用菌栽培中廣泛用于防治菇蚊、菇蠅的常用殺蟲劑，具有防效好、易分解、對食用菌產品質量安全等優點[5]。

由于化學殺蟲劑的長期使用，國外已有食用菌眼蕈蚊抗藥性的研究報道，例如美國賓夕法尼亞州和特拉華州的厲眼蕈蚊屬害蟲Lycoriellamali對芐氯菊酯產生高抗水平的抗性[6]。Shirvani-Farsani等[7]研究發現溴氰菊酯、煙草提取物不能有效控制食用菌的厲眼蕈蚊屬害蟲Lycoriellaauripila。國內也報道韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga對有機磷類、菊酯類和新煙堿類的抗藥性[8-9]，其中河南鄭州種群對毒死蜱、辛硫磷產生極高水平抗性，對高效氯氰菊酯產生中等水平抗性；山東李坡種群對噻蟲嗪產生高水平抗性[8]。目前，中國還沒有關于食用菌眼蕈蚊抗藥性的研究報道，近年來在國內主要食用菌栽培區的食用菌樣品中檢測到有機磷類(樂果、甲拌磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷)和擬除蟲菊酯類(溴氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯)殺蟲劑殘留超標[10-11]。研究發現，昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性機制包括表皮穿透率下降、靶標抗性以及代謝抗性，其中以代謝抗性機制較為普遍，昆蟲體內的多功能氧化酶(MFO)、羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)等解毒酶系的改變均與昆蟲對該類殺蟲劑的代謝抗性有關[12]。鑒于擬除蟲菊酯類是目前用于防治食用菌眼蕈蚊的常用殺蟲劑，且在防治食用菌眼蕈蚊中出現藥效降低和食用菌樣品的殘留問題，本試驗采用溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊種群進行抗性選育，進一步明確異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯產生抗藥性的潛在風險；通過增效劑的增效性和解毒酶的活性分析，旨在探究異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯代謝抗性形成的生化機理，從而為該蟲的抗性預防和治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蟲源 異遲眼蕈蚊于2014年3月采自云南省蒙自市文瀾鎮平菇菇房內，采用飼養籠(60 cm×60 cm×60 cm)和飼養盒(22 cm×15 cm×16 cm)進行室內飼養，期間不接觸任何藥劑。在飼養盒中放入滅菌的腐殖土作為飼養基質，添加黃豆粉作為營養補充。飼養和試驗處理條件為：溫度(25±1)℃、相對濕度為70%、光周期L/D=16 h/8 h。

1.1.2 試劑 25 g/L溴氰菊酯乳油，拜耳作物科學有限公司；95%增效醚(PBO)、96%順丁烯二酸二乙酯(DEM)、98%磷酸三苯酯(TPP)，阿拉丁試劑有限公司；丙酮，上海申博化工有限公司；α-萘酚(α-NA)、毒扁豆堿、固藍B 鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)、對硝基苯甲醚、對硝基苯酚、NADPH、牛血清蛋白、考馬斯亮藍，上海阿拉丁生化科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 異遲眼蕈蚊生物測定方法 采用薛明等[13]的幼蟲浸漬法，略做改動。將各藥劑稀釋成5～6個系列濃度(死亡率為20%～90%)，挑取大小一致的3齡幼蟲約20頭，放入底部鋪有濾紙的塑料瓶(直徑5 cm，高6 cm)中，用移液器滴加500 μL藥液于蟲體上浸漬30 s，用濾紙吸掉過量藥液后放入培養基質進行飼養。設無菌水為對照，每個濃度重復3次，24 h后觀察死亡情況(毛筆輕觸蟲體無反應判定為死亡)。

1.2.2 異遲眼蕈蚊抗性選育 抗性選育包括敏感品系和抗性品系的選育。

敏感品系：采用郭天鳳等[14]的單體選育法，略做改動。將羽化的單對成蟲放入塑料瓶(直徑8.5 cm，高11 cm)中(內置2%水瓊脂)進行交配繁殖，建立30個穩定種群。待異遲眼蕈蚊種群繁殖到一定數量后，用選育前品系的LC10溴氰菊酯濃度處理試蟲，采用“1.2.1”中方法測定各種群對溴氰菊酯的敏感性，挑選出死亡率較高的3～4個種群混合飼養，作為下一代篩選的蟲源，每隔3代進行1次生物測定。

抗性品系：采用群體選育法進行，以溴氰菊酯(上一代3齡幼蟲死亡率為40%～60%的濃度)處理群體飼養的3齡幼蟲，放入藥液浸漬30 s，用相同濃度藥劑處理滅菌的腐殖土用于飼養幼蟲，待存活3齡幼蟲發育至成蟲階段，將羽化成蟲接入不含藥劑的腐殖土中隔離飼養，作為下一代篩選的蟲源，每隔3代進行1次生物測定。

1.2.3 抗性現實遺傳力估算和抗性風險評估 采用Tabashnik等[15]的閾性狀分析方法估算抗性現實遺傳力h2。依據抗性現實遺傳力h2，預測不同選擇壓抗性上升10倍所需的篩選代數。

1.2.4 增效毒力測定 采用抗性選育中敏感性篩選的F12為敏感品系，抗性篩選的F24為抗性品系進行增效毒力測定。參照郭天鳳等[14]的方法，略做改動。通過預試驗確定PBO、TPP和DEM 3種增效劑最高使用質量濃度為60 mg/L，對異遲眼蕈蚊3齡幼蟲的存活和取食無不良反應。將3齡幼蟲約20頭浸入各增效劑(60 mg/L)10 s取出，待增效劑晾干轉入培養基質飼養，12 h后進行幼蟲毒力測定，3次重復，增效比=單劑LC50/(單劑+增效劑)LC50。

1.2.5 解毒酶活性測定 羧酸酯酶(CarE)活性測定參照余慧靈等[16]方法[CarE比活力單位為：mmol/(min·mg)]。谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活性測定參照余慧靈等[16]方法[GSTs比活力單位為：mmol/(min·mg)]。多功能氧化酶O-脫甲基(MFO)活性測定參照余慧靈等[16]方法[MFO比活力單位為：nmol/(min·mg)]。酶原蛋白質含量測定參照Bradford[17]的考馬斯亮藍G-250法。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0軟件對異遲眼蕈蚊的生物測定數據進行統計分析，采用單因素和 Duncan法進行方差分析和多重比較，用概率單位回歸法(Probit)計算毒力回歸直線方程、致死中濃度(LC50)和 95%置信區間。

2 結果與分析

2.1 異遲眼蕈蚊敏感品系的選育

采用單體選育法對異遲眼蕈蚊敏感品系進行選育(表1)，總體上溴氰菊酯對3齡幼蟲的LC50呈逐漸下降的趨勢，篩選至F18代后溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊3齡幼蟲的致死中質量濃度LC50為 12.413 mg/L，抗性倍數僅為F0代的0.74倍。其中F0～F9代的LC50下降趨勢相對較快，而 F15～F18代的LC50基本維持不變，說明篩選的敏感品系的敏感性已基本趨于穩定。

表1 溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊種群的敏感性篩選Table 1 Selection of susceptibility to deltamethrin in B.difformis

2.2 異遲眼蕈蚊抗溴氰菊酯品系的選育

溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊的抗性篩選見表2，篩選至F24代后，溴氰菊酯對3齡幼蟲的LC50由最初的16.621 mg/L上升至141.070 mg/L，抗性倍數達到8.49倍；相對于室內敏感品系最終選育結果(LC50為12.413 mg/L)，其抗性倍數達到11.36倍，說明通過室內連續篩選24代后異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯已經達到中等抗性水平。在抗性選育過程中， F0～F9代的抗性倍數增長速度緩慢；F12～F24代的抗性倍數增長速度呈逐漸增大趨勢。

表2 溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊種群的抗性篩選Table 2 Selection of resistance to deltamethrin in B.difformis

2.3 異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性現實遺傳力和發展速率預測

異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性現實遺傳力分析見表3，通過連續24代的抗性篩選，至F24代現實遺傳力h2為0.077 1，其中在抗性篩選前期(F0～F9)的h2較低，抗性上升較為緩慢；而在F12～F24期間，h2明顯增大，抗性發展速度明顯提升。

根據估算的異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性現實遺傳力h2=0.077 1，平均斜率1.509 0，即表型標準差δp=0.662 7，以溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊的致死率分別為50%、60%、70%、80%、90%和99%作為選擇壓力，預測抗性提高 10倍所需的代數。從圖1可看出，異遲眼蕈蚊的抗性發展速率隨藥劑致死率的提高而逐漸加快，當選擇壓力在50%～80%時，抗性增加10倍需要14～25代；選擇壓力在80%～90%時，抗性增加10倍需要11～14代。

2.4 增效劑對溴氰菊酯的增效毒力測定

由表4可知，在敏感品系中3種增效劑對溴氰菊酯的增效作用均不顯著，而在抗性品系中PBO和TPP對溴氰菊酯的增效作用顯著，其中PBO對溴氰菊酯的增效程度最強(F=204.35，P< 0.05)，對抗性品系的增效比為2.32倍；TPP對溴氰菊酯也有明顯的增效作用(F= 86.12，P<0.05)，對抗性品系的增效比為1.75倍；而DEM對溴氰菊酯的增效作用不顯著。初步表明異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯代謝抗性的提高與多功能氧化酶和羧酸酯酶有關。

表3 異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性現實遺傳力Table 3 Realized heritability of resistance to deltamethrin in B.difformis

注：R.選擇反應;P.篩選存活率;i.選擇強度;δp.表現型標準方差;S.選擇差異。

Note.R.Response to selection;P.Mean survival percentage of the selection generation;i.Intensity of selection;δp.Phenotypic standard deviation;S.Selection difference.

圖1 不同選擇壓力下異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯抗性提高 10 倍所需代數Fig.1 Generations to develop 10-fold resistance of B.difformis to deltamethrin under different selection pressures

2.5 不同抗性選育代數的多功能氧化酶O-脫甲基活性

由圖2可看出，隨著抗性選育代數的增加，多功能氧化酶O-脫甲基活性的活性逐漸增強，其中F0～F9代多功能氧化酶O-脫甲基活性變化不顯著，篩選至F12代酶活性已顯著上升(P<0.05)，變化倍數為1.34倍。篩選到F24代時酶活性變化倍數為1.83倍，達到差異顯著(P<0.05)，說明異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯抗性的提高與多功能氧化酶O-脫甲基活性增強有直接關系。

2.6 不同抗性選育代數的谷胱甘肽S-轉移酶活性

由圖3表明，隨著抗性選育代數的增加，谷胱甘肽S-轉移酶活性的變化程度較小，出現先下降(F0～F6)，后上升(F9～F24)的趨勢。篩選至F24代時，酶活性變化倍數僅為1.07倍，酶活性變化不顯著。說明異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯抗性的提高并沒有引起谷胱甘肽S-轉移酶活性的明顯變化。

表4 增效劑在異遲眼蕈蚊不同品系對溴氰菊酯的增效作用Table 4 Synergistic effect to deltamethrin in different strains of B.difformis

不同字母表示不同代數存在差異顯著(P<0.05)，下同。

Different letters indicate significant difference(P<0.05) among different generation,the same below.

圖2 不同抗性選育代數的多功能氧化酶O-脫甲基比活力
Fig.2 Specific activity of O-demethylation of MFOin different generations of resistance selection

圖3 不同抗性選育代數的谷胱甘肽S-轉移酶比活力Fig.3 Specific activity of GSTs in different generations of resistant selection

2.7 不同抗性選育代數的羧酸酯酶活性

由圖4可看出，隨著抗性選育代數的增加，羧酸酯酶活性的活性逐漸增強，其中F0～F9代羧酸酯酶活性變化不顯著，篩選至F12代酶活性已顯著上升(P<0.05)，變化倍數為1.20倍。篩選到F24代時酶活性變化倍數為1.40倍，達到差異顯著(P<0.05)，說明異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯抗性的提高與羧酸酯酶活性增強有直接關系。

3 討 論

本研究采用溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊進行抗性選育，抗性篩選至24代后抗性倍數增長11.36倍，說明經過室內篩選24代后異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯已經達到了中等水平抗性。目前國內多個食用菌栽培區的食用菌樣品中已檢測出溴氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯的殘留問題[10-11]，以及國外關于溴氰菊酯不能有效控制食用菌的厲眼蕈蚊屬害蟲(L.auripila)的研究報道[7]，均反映出食用菌眼蕈蚊主要種類(厲眼蕈蚊屬、遲眼蕈蚊屬)存在對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗藥性的風險。

圖4 不同抗性選育代數的羧酸酯酶比活力Fig.4 Specific activity of CarE in different generations of resistant selection

抗性風險評估是在抗性選育的基礎上，根據抗性現實遺傳力預測一定選擇壓力下抗性發展速率是目前常用的抗性風險評估方法。本研究表明異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性現實遺傳力h2為0.077 1，當選擇壓力在80%～90%時，抗性增加10倍需要11～14代。劉洪霞等[18]發現通過17代抗性選育，白紋伊蚊(Aedesalbopictus)對溴氰菊酯的現實遺傳力h2為0.125 7，表明白紋伊蚊對溴氰菊酯抗性風險較大。魏緒強等[19]發現通過21代抗性選育，家蠅(Muscadomestica)對溴氰菊酯的現實遺傳力h2為0.157 1，表明家蠅對溴氰菊酯抗性風險較大。徐 鹿[20]研究表明灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)對溴氰菊酯的現實遺傳力h2為0.061，表明灰飛虱對溴氰菊酯的抗性風險較小。說明衛生害蟲對溴氰菊酯的抗性風險明顯高于農業害蟲，主要是由于衛生害蟲受到的藥劑選擇壓力明顯高于農業害蟲，從而引起現實遺傳力h2的增大。本研究結果雖然表明異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的抗性風險較低，但研究發現現實遺傳力h2在害蟲不同的抗性選育階段存在一定的波動情況[18-20]，因此在食用菌生產中也要盡量降低溴氰菊酯的使用濃度，延緩異遲眼蕈蚊抗性的發展。

通過對異遲眼蕈蚊不同品系的增效測定發現，在抗性品系中PBO和TPP對溴氰菊酯的增效作用顯著。對異遲眼蕈蚊抗性篩選中的不同世代的解毒酶活性分析表明：隨著篩選代數的增加，多功能氧化酶O-脫甲基和羧酸酯酶的活性顯著增加，證實異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯抗性的提高與多功能氧化酶和羧酸酯酶活性增強有密切關系。這與Bartlett等[21]研究厲眼蕈蚊屬害蟲(L.mali)抗芐氯菊酯品系和敏感品系的多功能氧化酶單加氧酶活性、El-Latif 等[22]研究棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)抗溴氰菊酯品系和敏感品系的酯酶活性、Yang等[23]研究棉鈴蟲抗溴氰菊酯品系和敏感品系的中腸微粒體對溴氰菊酯的氧化代謝的結果相似。主要原因可能是與擬除蟲菊酯類殺蟲劑的生物代謝作用位點有關，研究發現擬除蟲菊酯類殺蟲劑最主要的生物代謝反應是酯鍵的清除，由于大多數擬除蟲菊酯殺蟲劑都是羧酸酯類。因此，容易被羧酸酯酶水解，氧化作用也可導致對擬除蟲菊酯類藥劑中酯鍵的清除[23]。

本研究主要從生理生化水平研究異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的代謝抗性，研究結果僅說明多功能氧化酶和羧酸酯酶參與異遲眼蕈蚊對溴氰菊酯的代謝抗性形成，但兩類解毒酶的抗性基因及表達水平，以及相關解毒酶對溴氰菊酯的代謝作用等問題還未明確。因此，在后續的研究中還需要從分子水平上探索抗性的形成和發展機制，通過生理生化水平和分子水平兩個方面的相互應證，才能系統揭示該蟲對溴氰菊酯的代謝抗性形成及其主導的抗性機制。