干旱脅迫對豬苓菌絲生長及多糖合成相關(guān)酶活性的影響

徐夢馨，郭宏波，廉 冬，馬珍璐，張躍進，孫建華

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.陜西漢王略陽中藥科技有限公司，陜西略陽 724300)

豬苓[Polyporusumbellatus(Pers.) Fries]為多孔菌科藥用真菌，別名豬屎苓、豬茯苓、野豬糞等，以干燥菌核入藥，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕功效，臨床常用于治療小便不利、水腫、泄瀉、淋濁和帶下等癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，豬苓中含有豬苓多糖、甾體等多種有效成分[2]，其中豬苓多糖可以提高機體免疫力，并通過抗氧化抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制腫瘤基因表達(dá)[3-8]。

隨著豬苓多糖抗癌作用的發(fā)現(xiàn)以及中國醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展,以豬苓為原料的成品藥也不斷開發(fā),豬苓藥材市場需求呈增加趨勢，有關(guān)豬苓的研究及人工栽培備受關(guān)注[9]。然而，目前豬苓的生物學(xué)特性尚不完全清楚，人工半野生栽培需時較長、產(chǎn)量低。豬苓袋料培養(yǎng)及液體培養(yǎng)具有成本低、增殖快等優(yōu)點，是豬苓藥材今后發(fā)展的一個重要方向。本試驗是在前期研究工作的基礎(chǔ)上，研究不同干旱脅迫條件對豬苓液體培養(yǎng)中菌絲生長、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和多糖合成相關(guān)酶活性的影響，以揭示豬苓菌絲耐干旱脅迫程度及其與多糖合成之間的關(guān)系。為豬苓菌絲干旱脅迫適應(yīng)機制及豬苓多糖合成代謝途徑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株為西北農(nóng)林科技大學(xué)中藥材規(guī)范栽培實驗室保藏菌種，產(chǎn)地來源為陜西略陽，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)舒志明副教授鑒定為多孔菌科豬苓(P.umbellatus)菌種。培養(yǎng)基為改良完全培養(yǎng)基，設(shè)置不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200、250 g/L)PEG-6000處理進行液體培養(yǎng)，將豬苓菌種接種后，在恒溫?fù)u床中25 ℃、150 r/min黑暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)菌絲用于后續(xù) 試驗。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 生物量測定 豬苓液體培養(yǎng)7 d后，過濾收集豬苓菌絲，于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，進行稱量，計算生物量。各處理隨機取樣，重復(fù)3次，下同。

1.2.2 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 取烘干至恒質(zhì)量的豬苓菌絲，粉碎后過60目篩。稱取0.10 g粉末，加入30倍蒸餾水，超聲波提取，重復(fù)2次，合并濾液。以葡萄糖為對照，采用硫酸—蒽酮法繪制葡萄糖濃度/吸光度(X/Y)標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=10.096X-0.030 9(R2=0.999 8)。取待測液測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 抗氧化酶活性測定 參照李合生[10]的方法測定新鮮豬苓菌絲各項生理指標(biāo)，采用氮藍(lán)四唑(NBT) 法測定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD) 活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶(CAT)活性。

1.2.4 丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度測定 采用硫代巴比妥酸(TBA) 法測定新鮮豬苓菌絲中MDA質(zhì)量摩爾濃度。

1.2.5 可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定新鮮豬苓菌絲中可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.6 游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 采用磺基水楊酸法測定新鮮豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)。

1.2.7 多糖合成相關(guān)酶活性測定 取不同處理下的新鮮豬苓菌絲，準(zhǔn)確稱取0.50 g，加2.5 mL 預(yù)冷細(xì)胞提取緩沖溶液(20 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖溶液，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/LDTT，pH 6.5)，4 ℃，14 000 r/min離心15 min，取上清，獲得酶液樣品，待測。參照Schaffer等[11]的方法測定己糖激酶(HK)活性；參照Looijesteijn等[12]的方法測定α-磷酸葡萄糖變位酶(α-PGM)和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)的活性。以不加酶液為空白對照，在340 nm處檢測輔酶Ⅱ NADP(H)的變化，從加入酶液開始讀數(shù)，以反應(yīng)體系中每分鐘增加或減少1 nmol的輔 酶Ⅱ NADP(H) 定義為1個酶活單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 21.0和Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對豬苓菌絲生長的影響

2.1.1 菌絲生物量 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲生物量的影響較大，如圖1所示。豬苓菌絲生物量隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢，PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L，表現(xiàn)為促進作用，當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，豬苓菌絲生物量最高，較對照組顯著增加60.40%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為200 g/L時，豬苓菌絲生物量與對照組無顯著差異。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時，豬苓菌絲生長受到抑制。說明適度干旱脅迫有利于豬苓菌絲生長，隨著干旱程度增大，豬苓菌絲生長受到一定威脅。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同 Different lowercase letters indicate the significant difference among different treatments(P<0. 05) . The same below．

圖1 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲生物量
Fig.1 Biomass ofP.umbellatusmyceliumunder different drought stresses

2.1.2 菌絲中抗氧化酶活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中POD活性的影響較大，如圖2-A所示。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L時，豬苓菌絲中POD活性顯著高于對照組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，POD活性最高，并顯著高于其他處理組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50、100和150 g/L時，POD活性分別較對照組增加6.47倍、9.34倍和12.09倍。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，豬苓菌絲中POD活性顯著降低，與對照組無顯著差異。

不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中CAT活性的影響較大，如圖2-B所示。CAT活性隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先降低后升高的趨勢。對照組CAT活性顯著高于各處理組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L和150 g/L時，豬苓菌絲中CAT活性最低，且二者之間無顯著差異，分別較對照組減少17.82%和 15.15%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，CAT活性增強，但仍顯著低于對照組。

不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中SOD活性的影響較大，如圖2-C所示。SOD活性與POD活性變化一致，隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，豬苓菌絲中SOD活性最高，較對照組增加2.44倍。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L，SOD活性呈下降趨勢，但在試驗范圍內(nèi)顯著高于對照組。

以上研究結(jié)果表明，PEG-6000模擬干旱脅迫處理下，豬苓菌絲具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，以緩解干旱脅迫的抑制作用。

圖2 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activities of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.1.3 菌絲中丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響較大，如圖3-A所示。豬苓菌絲中MDA質(zhì)量摩爾濃度隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度最高，較對照組顯著增加61.01%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度呈下降趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為200 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度與對照組無顯著差異；當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著低于對照組。

2.1.4 菌絲中游離脯氨酸(Pro)質(zhì)量分?jǐn)?shù) 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較大，如圖3-B所示。豬苓菌絲中游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先降低后升高的趨勢。其中，對照組游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且顯著高于各處理組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L時，豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，較對照組顯著減少59.61%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L 時，豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，但在試驗范圍內(nèi)顯著低于對照組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100～250 g/L時，不同處理組間游離脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著。

2.1.5 菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù) 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較小，如圖3-C所示。豬苓菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50～100 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，與對照組無顯著差異。其中，當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，較對照組增加8.80%。PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，豬苓菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對照組增加 6.98%，二者差異不顯著。而PEG-6000質(zhì)量濃度為200～250 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對照組顯著降低15.30%和20.12%。

以上研究結(jié)果表明，干旱脅迫會引起豬苓菌絲細(xì)胞損傷，適度干旱脅迫條件下豬苓菌絲具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，以緩解干旱脅迫的抑制 作用。

圖3 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度(A)、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)及可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)Fig.3 MDA molality (A) , proline mass fraction (B) andsoluble protein mass fraction(C) of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.2 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較大，如圖4所示。豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度≤100 g/L時，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，較對照組顯著增加1.06倍。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢，但在試驗范圍內(nèi)均高于對照組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L和200 g/L時，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對照組顯著增加57.61%和 22.73%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照組差異顯著。適度干旱脅迫能夠提高液體培養(yǎng)豬苓菌絲中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖4 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.4 Polysaccharide mass fraction of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.3 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對豬苓菌絲中多糖合成相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 己糖激酶(HK)活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中HK活性的影響較大，如圖5-A所示。不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下，豬苓菌絲中HK活性與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50 g/L時，豬苓菌絲中HK活性升高，與對照組無顯著差異。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，HK活性較對照組顯著升高27.88%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，HK活性呈下降趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，HK活性較對照組升高 5.30%，二者差異不顯著。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為200 g/L和250 g/L時，HK活性分別較對照組顯著降低15.58%和29.75%。

2.3.2 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中GPI活性的影響較大，如圖5-B所示。豬苓菌絲中GPI活性與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50 g/L時，GPI活性較對照組顯著增加10.60%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，GPI活性達(dá)到最高，較對照組顯著增加19.89%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，GPI活性呈下降趨勢，但在試驗范圍內(nèi)顯著高于對照組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為150～250 g/L時，GPI活性分別較對照組顯著增加16.54%、13.80%和 11.94%。

2.3.3 α-磷酸葡萄糖變位酶(α-PGM)活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中α-PGM活性的影響較大，如圖5-C所示，豬苓菌絲中α-PGM活性與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢。各處理組α-PGM活性均高于對照組。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為100、150和200 g/L時，α-PGM活性分別較對照組顯著增加28.73%、18.53%和15.73%。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度為50 g/L和250 g/L時， α-PGM活性分別較對照組增加6.10%和 2.11%，差異不顯著。

以上研究結(jié)果表明，豬苓菌絲中己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、α-磷酸葡萄糖變位酶活性與豬苓多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，且適度干旱脅迫可以提高其活性。

圖5 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中己糖激酶(A)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(B)和α-磷酸葡萄糖變位酶(C)活性Fig.5 Activities of HK (A), GPI (B) and α-PGM (C) of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

3 結(jié)論與討論

高巧妮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豬苓菌核培養(yǎng)過程中水分變化會對豬苓菌絲生長產(chǎn)生重要影響。本研究通過外源添加PEG-6000模擬干旱脅迫，探究其對豬苓菌絲生長及多糖合成相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明，在不同質(zhì)量濃度PEG-6000模擬干旱脅迫下，豬苓菌絲生長和多糖合成相關(guān)酶活性均受到一定影響。

水分是中藥材人工栽培過程中影響藥材產(chǎn)量的重要因素。干旱脅迫抑制植株生長，且抑制作用隨脅迫程度增大而增大。劉艷等[14]研究結(jié)果表明，輕度干旱脅迫促進甘草根系生長。高揚[15]研究結(jié)果表明，中度干旱脅迫抑制丹參干物質(zhì)積累。本研究結(jié)果表明，PEG-6000質(zhì)量濃度≤150 g/L時促進豬苓菌絲生長，PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時顯著抑制豬苓菌絲生長。

SOD、POD和CAT是生物體內(nèi)的保護酶，與機體抗逆性緊密相關(guān)，本研究結(jié)果表明，當(dāng)豬苓菌絲遭受不同程度干旱脅迫時，這3種酶表現(xiàn)出不同的活性。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度≤150 g/L時，豬苓菌絲中SOD和POD活性顯著升高，CAT活性顯著降低，說明豬苓菌絲具有一定適應(yīng)干旱脅迫的能力。當(dāng)PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，豬苓菌絲生物量、POD活性、SOD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨脅迫程度增大顯著降低。說明豬苓菌絲適應(yīng)干旱脅迫能力具有一定范圍，超過此范圍會導(dǎo)致豬苓菌絲中保護酶功能失衡，過氧化程度加劇，造成細(xì)胞損傷。

干旱是全球普遍存在的現(xiàn)象，全球氣候變暖和雨水不均導(dǎo)致的干旱脅迫會對作物生長及次生代謝物合成產(chǎn)生影響。中藥材人工栽培過程中常受到干旱的影響，但適度干旱脅迫有利于道地藥材形成[16]。周雪潔等[17]研究結(jié)果表明，中度干旱脅迫后短期復(fù)水可以促進甘草酸積累。高揚[15]研究結(jié)果表明，中度干旱促進丹參中丹參素和丹參酮ⅡA的積累。本研究結(jié)果表明，適度干旱脅迫有利于提高豬苓菌絲中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并提高多糖合成相關(guān)酶活性，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與HK、GPI和α-PGM 3種酶活性變化趨勢一致，此結(jié)果與余吳夢曉等[18]及李潔[19]的研究結(jié)果一致。目前豬苓多糖合成代謝途徑尚不明確，但有關(guān)多糖合成酶的相關(guān)研究卻較多。有研究表明，HK在糖核苷酸合成途徑以及糖代謝途徑中可能扮演重要角色[20-22]，GPI和α-PGM是多糖合成途徑的關(guān)鍵酶[23-28]，該3種酶是否為豬苓多糖合成的關(guān)鍵酶還有待進一步研究。