水稻中2個小分子熱激蛋白基因啟動子的序列分析及功能鑒定

郭虹霞，王創云，趙 麗，王陸軍，張麗光，鄧 妍

(山西省農業科學院 作物科學研究所，太原 030031)

水稻作為最主要的糧食作物之一，世界約50%的人口以稻米為主要糧食，為人類的糧食安全作出了巨大貢獻。水稻的生長在一定程度上受到各種逆境脅迫的影響，溫度是影響水稻生長發育最主要的氣候因子，研究表明，適溫以上，氣溫每升高1℃，水稻的產量會減少10%[1]。全球氣溫的持續升高，嚴重制約著水稻的生產，當前亟需深入水稻耐熱的分子機制研究，確保水稻生產的可持續發展。

熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)是指生物遭受逆境脅迫時(如高溫)體內新合成或含量增加的一類具有分子伴侶活性的蛋白質[2]。根據分子質量的大小，熱激蛋白可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP(small heat shock proteins)[3-4]5個家族，小分子熱激蛋白(sHSPs)是最重要的一類分子伴侶，其分子質量一般為15～50ku，不同于其他大部分熱激蛋白家族成員間的高度保守， sHSPs基因間的氨基酸序列相似性不足25%，在其二級結構中含有一個80～100個氨基酸組成的保守的ACD(α-晶體蛋白結構域)結構域。sHSPs在植物熱激蛋白中含量最為豐富[5]，與植物耐熱性關系密切[3]。正常生長條件下，大多數sHSP在植物組織中不積累,而在熱激或其他脅迫的誘導下，sHSP 的含量急速增加[6]，有的甚至可提高200倍以上；有些sHSP在植物生長發育的特定時期如胚胎發生、花粉粒發育、種子萌發、種子及果實成熟等過程中表達[7-8]。研究表明，高溫脅迫下，sHSP能自發形成大小為200～300ku的同源寡聚體，并與其他分子伴侶相互作用，幫助受損蛋白重新折疊。除了在耐熱脅迫方面的重要作用外，sHSPs對冷、旱、鹽等脅迫的防御也具有重要作用[9]。研究表明，超表達水稻Hsp17.7基因，可以提高水稻的耐熱性和抗旱性[10-11]，過量表達葉綠體sHSPs[12-13]和ER-sHSPs[14]能提高番茄的抗寒性。此外，sHSPs還有抑制細胞凋謝、促進細胞骨架形成，及保護電子傳遞鏈(線粒體sHSP)和光系統Ⅱ的電子傳遞(葉綠體sHSP)等作用[15]。

前期研究表明，在水稻幼穗分生組織進行枝梗原基分化和花器官原基分化初期有種類豐富的熱激蛋白基因及其共分子伴侶和熱激轉錄因子高水平特異表達。其中2個基因是位于1號染色體編碼sHSP的基因Os01g0136200和Os01g 0136100(分別命名為Os16.9A和Os16.9B)，Os16.9A和Os16.9B大小相同，結構相似，都不含內含子。

本試驗對Os16.9A和Os16.9B的啟動子進行生物信息學分析，并利用過量表達和Cas9基因編輯技術研究Os16.9A和Os16.9B與水稻耐熱性的關系，為深入研究Os16.9A和Os16.9B的功能奠定了基礎，對深入了解熱激蛋白參與植物正常生長發育及防御脅迫應答的分子機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試植物材料為粳稻品種‘中花11’，大腸桿菌菌株DH10B為山西省農業科學院作物科學研究所實驗室保存；植物超表達載體pBWA(V)KS-ccDB和基因編輯載體pBWA(V)H_cas9i2- 01g04380由武漢伯遠生物科技有限公司提供；限制性內切酶、DNA Ligation Kit Ver.2購自Takara公司；凝膠回收試劑盒購自東盛生物公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA測序由上海英駿生物技術公司完成。

1.2 生物信息學分析

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網站上，利用tBLASTN軟件對Os16.9A、Os16.9B基因進行同源性分析，通過DNAStar、MEGA6軟件構建Os16.9A、Os16.9B及其同源蛋白的系統進化樹。

1.3 基因克隆及載體構建

1.3.1 過表達載體構建 以水稻葉片cDNA為模板總RNA。根據Os16.9A、Os16.9B序列設計引物(表1)，按照如下反應體系(引物1：0.2 μmol/L ，引物2：0.2 μmol/L，dNTP：200 μmol/L，10×Buffer：2 μL，Taq：1U，cDNA：4 ng，ddH2O：補齊50 μL)擴增(98 ℃預變性10 min；98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，32個循環；72 ℃延伸15 min，14 ℃10 min)目的片段，切膠、回收。將用凝膠純化試劑盒回收的 PCR 產物與空載體pBWA(V)KS-ccDB連接，轉化獲得重組質粒后，進行菌液 PCR，選PCR 擴增結果為陽性的菌液進行測序。重組載體見圖1。

1.3.2 基因編輯載體構建 根據Os16.9A、Os16.9B全長cds及基因組序列，在盡量靠近cds 5′端選定4個靶標，設計引物(表1),將靶標構建至中間載體，PCR反應條件為，95 ℃變性10 min，55 ℃退火10 min然后利用EcoR31Ⅰ限制性內切酶切割中間載體并進行多片段的組裝，獲得最終載體(圖2)，由于Os16.9A、Os16.9B序列的高度同源性，2個基因共用一個載體。

2 結果與分析

2.1 Os16.9A和 Os16.9B的同源性分析

通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 和http://rgp.dna.affrc.go.jp/E/ 網站分析發現Os16.9A和Os16.9B均位于水稻1號染色體PAC克隆P0443D08上，大小相同，轉錄方向相反(圖3)，且都含有共同的Alpha-crystallin結構(圖4)，將克隆的Os16.9A和Os16.9B所編碼的150個氨基酸進行比對發現，僅存在一個氨基酸的差異(圖5)，相似性高達到99%，軟件分析預測顯示Os16.9A和Os16.9B蛋白主要定位于細胞質和線粒體基質中。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

注：1-4表示構建超表達載體引物，5-12表示構建基因編輯載體引物；下劃線為酶切位點。

Note:1-4 Primers for over-expression vectors，5-12 primers for gene editing vectors；the underline marked the digestion site.

圖1 過表達載體圖譜Fig.1 Overexpression vector map

圖2 基因編輯載體圖譜Fig.2 Gene editing vector map

2.2 系統進化關系分析

利用網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/對Os16.9A和Os16.9B的氨基酸序列進行比對分析，結果顯示在水稻中與這2個基因的氨基酸相似性達50%以上的基因有8個，這些基因主要分布在1號染色體和3號染色體上，很可能是通過祖先基因的多次復制產生的。通過DNAStar、MEGA6軟件構建出系統進化樹(圖6)，這些蛋白可分為7個亞枝，Os16.9A和Os16.9B在同一分枝上，且Os16.9A、Os16.9B與Os01g0136000處于同一亞枝，表明Os16.9A、Os16.9B與Os01g0136000蛋白的親緣關系較近，而與其余蛋白親緣關系較遠。

圖3 目的基因在PAC克隆上的位置Fig.3 The location of target genes on PAC clones

a. Os16.9A；b. Os16.9B；c.Alpha-crystallin結構域 Alpha-crystallin domain

圖5 Os16.9A、 Os16.9B基因的氨基酸序列比較Fig.5 Amino acid sequences comparison of Os16.9A and Os16.9B

圖6 水稻中 Os16.9A、 Os16.9B氨基酸水平同源基因進化樹Fig.6 The phylogenetic tree of Os16.9A and Os16.9B proteins from rice

2.3 啟動子序列分析

對2個基因起始密碼子間2 590 bp的序列正反向進行了啟動子元件分析(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，發現其中不對稱分布了多種順式作用元件(圖7，表2)，其中HSE、ACGT aterd1、NTBBF1arrolb、GATA-box、CAAT-box、TATA-box在Os16.9A和Os16.9B啟動子區都存在，但是相對起始密碼子所在的位置有差別，而且Os16.9A和Os16.9B的TATA-box的具體序列不同。此外，G-box、LTRE、CCAAT-box是Os16.9A啟動子區所特有的，BSI是Os16.9B啟動子區所特有的。推測Os16.9A和Os16.9B可能在熱激等環境脅迫下及植物生長的特定時期表達，2個基因啟動子可能共用起始密碼子之間2 590 bp的序列或者這段序列可能具有雙向啟動子功能。

紅色標注Os16.9B的啟動子元件 The red is the promoter element ofOs16 .9B；綠色標注Os16.9A的啟動子元件 The green is the promoter element ofOs16 .9A；兩基因轉錄方向相反 The two genes are transcribed in the opposite direction

圖7Os16.9A、Os16.9B基因起始密碼子間的序列及其包含的啟動子元件
Fig.7 The sequence between the initiating codons of theOs16.9AandOs16.9Bgenes and the promoter elements

表2 Os16.9A、 Os16.9B啟動子元件序列及功能Table 2 The sequences and function of Os16.9A and Os16.9B promoter elements

2.4 轉基因植株的耐熱分析

為了研究Os16.9A和Os16.9B與水稻耐熱性的關系，本研究通過遺傳轉化獲得了Os16.9A和Os16.9B的過量表達及基因編輯轉化植株。同時將在同樣生長條件下的4葉期野生型‘中花11’、過量表達轉基因植株和基因編輯轉基因植株進行耐熱處理，比較它們的耐熱性是否存在差異。在42 ℃高溫處理2 h后，于正常生長環境下恢復生長3～5 d后觀察植株的生長情況，結果發現過表達轉基因植株的生長狀況好于野生型‘中花11’，而基因編輯轉基因植株則出現比較明顯的萎蔫，枯黃現象，生長狀況比野生型‘中花11’差 (圖8)。

熱處理前后，分別提取過表達、基因編輯及野生型‘中花11’植株葉片RNA，利用RT-PCR的方法檢測Os16.9A表達情況，結果表明，在正常生長條件下，過表達轉基因植株中表達量較對照‘中花11’高，而編輯轉基因植株中基本沒有表達；42 ℃熱激2 h后，‘中花11’和過表達轉基因植株表達量有所增加(圖9)。

a-c. 未處理的植株 Untreated plants; d-f. 42 ℃熱激處理2 h，恢復正常生長5 d后的植株 Plants treated at 42 ℃ for 2 h,then grow under normal growth conditions for 5 days; a、d . 過表達Os16.9B轉基因植株 Transgenic plants overexpressingOs16.9B; b、e .‘中花11’對照 ‘ZH11’ controls; c、f .Os16.9B基因編輯轉基因植株 Transgenic plants ofOs16.9Bgene deiting

圖8 苗期熱激處理
Fig.8 Heatshock treatment of rice seedling

M.DNA分子質量標準DL2000 DL2000 marker； 1-4.未熱激植株的RT-PCR結果 Result of the untreated plants ； 5-7. 42 ℃熱激2 h植株RT-PCR結果 Result of the plants treated at 42 ℃ for 2 hours； 1、2、5. ‘中花11’ ‘ZH11’; 3、6.Transgenic plants overexpressingOs16.9B;4、7.Os16.9B基因編輯轉基因植株 Transgenic plants ofOs16.9Bgene deiting

圖9 轉基因植株的RT-PCR結果
Fig.9 RT-PCR result of transgenic plants

3 討 論

水稻是世界上重要的糧食作物，高溫脅迫可嚴重影響水稻的育性和品質，因此需要對水稻耐熱的分子機制進行研究，確保水稻生產的可持續發展。

高等植物復雜的表達調控中，轉錄水平的調控發揮著重要作用。啟動子作為重要的調控開關，對其結構及功能的研究具有重要作用。Os16.9A和Os16.9B都編碼小分子熱激蛋白(sHSPs)，通過序列比對分析，發現Os16.9A和Os16.9B是位于水稻1號染色體PAC克隆P0443D08上的2個基因，它們的編碼框大小相同， 都不含有內含子。Os16.9A和Os16.9B之間僅存在1個氨基酸差異，氨基酸序列的相似性高達到99%，且都存在Alpha-crystallin結構，但是編碼框外的序列，如5′UTR和3′UTR則完全不同。

本研究對Os16.9A和Os16.9B起始密碼子間2 590 bp的序列分析，發現多種順式作用元件在2個基因啟動子區的分布是不對稱的，且大多與脅迫誘導和組織特異性表達有關。因此，推測這2個基因間的序列可能具有雙向啟動子的功能，且這2個基因可能在熱激等脅迫條件下及植物生長的特定時期表達。利用GUS報告融合系統對2個基因表達特性的研究結果[16]表明熱激會誘導這2個基因的大量表達，而在正常生長條件下，Os16.9A和Os16.9B在根、莖、幼穗的維管組織中表達，兩者的表達模式無論是在脅迫環境下還是正常發育過程中都基本相似，驗證了本試驗對于這2個基因間的序列可能具有雙向啟動子的功能，且這2個基因可能在熱激等脅迫條件下及植物生長的特定時期表達的推測。對轉基因植株的熱激處理發現，過表達Os16.9A和Os16.9B能夠提高水稻對高溫脅迫的耐受能力。

4 結 論

Os16.9A和Os16.9B起始密碼子之間2 590 bp的序列作為雙向啟動子驅動這2個基因反向轉錄，Os16.9A和Os16.9B的表達模式相似，在正常生長條件下，對于根、莖、幼穗的維管組織等分化和發育有關，且在熱激等環境脅迫時，能夠提高水稻對高溫等脅迫的耐受能力。