雙價豬流行性腹瀉病毒特異性雙峰駝源單域抗體的重組表達和特征分析

李 麗，楊順利，張辛銘，蔡建平，薛慧文，尹雙輝

(1.甘肅農業大學 動物醫學院，蘭州 730070；2.中國農業科學院 蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046)

豬流行性腹瀉病毒(Poreine epidemic diarrhea virus，PEDV) 屬于尼多病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，是引起豬流行性腹瀉(PED)的病原。PED是一種急性接觸性傳染病，可通過糞便、污染的飲水、飼料和環境迅速散播，病豬的主要特征為腹瀉、嘔吐和脫水，不同年齡階段的豬均可感染發病，但對哺乳仔豬具有較高致死率。目前的流行病學調查研究表明，PEDV已經遍及全球[1-2]，亞洲的爆發頻率也不斷增加，尤其是在養豬業較為發達的中國[3-5]，給養豬業帶來巨大損失。目前，滅活和弱毒疫苗已經在臨床廣泛使用，但由于PEDV感染的免疫學特征以及病毒的不斷變異，臨床不斷有PED發病和流行的報道。因此，對PED的快速、準確檢測，及時切斷其傳播環節，仍是PED防控的重要舉措。

抗體是常見血清學和病原學檢測方法中的重要組成部分，抗體的特性很大程度上決定了檢測方法的準確性和敏感性。重鏈抗體(HCAbs)是發現于駝科和軟骨魚等動物體內的一種天然缺失輕鏈，僅有重鏈的抗體[6]。這類抗體的抗原結合結構域僅由重鏈可變區構成，稱此可變區片段為單域抗體(Single domain antibody，sdAb)，由于其分子質量僅15 ku，是單克隆抗體的1/3，因此也稱其為納米抗體(Nanobody)。sdAb是目前可以得到的具有完整功能的最小抗體分子，sdAb具有比普通抗體更大的重鏈可變區(VH)抗原結合環結構，更長的第三互補決定區(CDR3)，能夠形成更多的新結構，因而補償了輕鏈可變區(VL)抗原結合位點的缺失，僅靠3個CDR就具備特異的抗原結合能力及高親和力。此外，已有研究證實sdAb還具有容易在大腸桿菌表達系統表達、具有高水溶性、耐高溫和極端pH等獨特性質[7-8]。鑒于此，sdAb在醫學、生物技術、診斷和治療領域得到廣泛應用[9-12]。

成本低廉、獲得容易、具有高親和性和特異性的抗體是檢測方法研發所追求的理想材料。本研究對已經獲得的4株PEDV 膜蛋白特異性sdAb(sdAb-Mcs)進行結構分析并構建雙價抗體。分析雙價抗體的溫度耐受性、pH耐受性、競爭活性和M蛋白捕獲特性，獲得具有很好病原捕獲活性和競爭活性的雙價sdAb-Mcs。為建立高度敏感和特異的PEDV檢測方法提供廉價的材料基礎，同時也為sdAb的有效應用提供更多思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗涉及的限制性內切酶均購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒和大腸桿菌感受態細胞購自北京全式金生物公司；異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工；膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；His-tag純化樹脂購自德國Qiagen公司；96孔酶標板購自美國Coster公司； 0.45 μm濾膜和PVDF膜購自德國millipore公司；牛血清白蛋白(BSA)，碳酸鹽包被緩沖液和TMB底物顯色液購自美國Sigma公司；HRP酶標記抗His-tag抗體購自北京博奧龍免疫技術有限公司；HRP酶標記抗兔抗體購自美國Abcom公司；ECL顯色液購自美國Thermo公司；pET-32a表達載體、帶有His和GST標簽的重組PEDV膜蛋白、膜蛋白高免兔血清以及膜蛋白特異性sdAb為中國農業科學院蘭州獸醫研究所豬禽消化道感染和黏膜免疫研究創新團隊實驗室保存；其他常規試劑為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 PEDV特異性單域抗體結構模擬分析及雙價抗體的構建 利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 在線軟件，對PEDV特異性單域抗體sdAb-Mc19(Genbank access NO.: MH550664)、sdAb-Mc29(MH550665)、sdAb-Mc30(MH550666)和sdAb-Mc37(MH550 667)[13]，進行結構模擬分析。用已公布的雙峰駝源sdAb晶體結構(5lz0)為模板[14]，利用SPDBV 4.0 軟件繪結構圖。

利用BamHⅠ，HindⅢ和XholⅠ酶切位點，將雙拷貝的sdAb-Mc19/29/30/37基因分別克隆到 pET-32a(+) 載體，同時兩個拷貝sdAb之間引入15個氨基酸的柔性氨基酸序列[15]。連接產物轉化到大腸桿菌(DH5α)感受態細胞，挑選陽性克隆并進行測序分析。

1.2.2 雙價sdAb的表達、純化與鑒定 將陽性質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，將含有重組質粒PET-32a-sdAb-Mc19-19 /29-29 /30-30 /37-37的單菌落分別接種到新鮮Lysogeny broth(LB)培養基(含100 μg/mL Ampicillin)，37 ℃振蕩培養過夜，次日按照體積比1∶100的接種量，將菌轉接至3 mL 新鮮LB培養基(含100 μg/mL Ampicillin)中，振搖至OD600約為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度 0.001 mol/L，25 ℃誘導10 h后，8 000 r/min離心收集菌體。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

確定表達后，大量誘導表達重組菌，收集菌體。用Tris-HCL緩沖液(pH 8.0)重懸，置冰上用超聲儀進行細胞裂解，然后12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清。上清液用0.45 μm濾膜過濾并加入到His標簽蛋白親和層析柱，按操作說明進行目的蛋白純化。獲得的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分析。用Nanodrop2000超微量分光光度計測濃度后，分裝，-80 ℃保存。

Western blot驗證，將表達菌液上清用φ=12% SDS-PAGE分離并轉到PVDF膜。用BSA-PBS 封閉液 (1×PBS，含50 g/L的BSA，pH 7.4) ， 4 ℃，過夜封閉；次日，用PBST (1×PBS，含φ=0.1% Tween-20，pH 7.4) 洗3次；然后，與HRP標記的抗His標簽蛋白單克隆抗體室溫孵育1 h，PBST洗5次后，用ECL底物顯色液，暗盒曝光顯色。

1.2.3 重組雙價sdAb-Mcs與M蛋白結合活性分析 用間接ELISA方法，檢測重組雙價sdAb-Mcs與M蛋白的結合活性[13]。用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋帶有GST標簽的重組M蛋白(M-GST)至終質量濃度為10 μg/mL，過夜包被酶標板；次日，用PBST洗板3次，用BSA-PBS封閉緩沖液室溫封閉1 h；PBST再次洗板3次，加入系列稀釋的sdAb-Mc19-19/29-29/30-30/37-37至終質量濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16 和 0 μg/mL，50 μL/孔，37 ℃孵育1 h；隨后，PBST洗板5次，加入HRP標記的抗His標簽蛋白抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗板，加入四甲基聯苯胺(TMB)底物顯色液，室溫避光孵育15 min；讀取OD450值。設置GST標簽蛋白包被孔為對照。

同時，通過Western blot 方法驗證雙價sdAb-Mcs與M-GST蛋白的結合活性。用12% SDS-PAGE分離M-GST蛋白后，轉到PVDF膜；用BSA-PBS封閉緩沖液，室溫封閉PVDF膜 2 h；然后將PVDF膜與sdAb-Mc19-19 /29-29 /30-30 /37-37，4 ℃過夜孵育；隨后，PBST洗膜5次，并與HRP標記抗His抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗膜5次，用ECL底物顯色液，暗盒曝光顯色。

1.2.4 溫度耐受性分析 將重組的單價和雙價sdAb-Mcs分別置于30～90 ℃水浴1 h，然后，通過ELISA方法檢測不同溫度處理后的抗體M蛋白結合活性。過程如下：用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋M-GST蛋白至10 μg/mL，過夜包被酶標板；然后，用BSA-PBS封閉緩沖液室溫封閉 2 h；PBST洗板3次，加入不同溫度條件下處理的sdAb，質量濃度為5 μg/mL，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h；再次洗板5次，加入HRP標記的抗His抗體， 37 ℃ 孵育1 h；洗板5次，加入TMB底物顯色液，室溫避光15 min；讀取OD450值。

1.2.5 pH耐受性分析 將重組的單價和雙價sdAb-Mcs分別置pH為2～11的Tris-HCl中，重組抗體質量濃度為5 μg/mL。然后，將不同pH的重組抗體加入到M-GST蛋白(10 μg/mL)包被的酶標板，37 ℃孵育1 h；隨后，PBST洗板5次，加入HRP標記的抗His抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗板，加入TMB底物顯色液，室溫避光 15 min；讀取OD450值。

1.2.6 競爭活性分析 分別將2.5 μg、5 μg、10 μg和20 μg的單價和雙價sdAb-Mcs與1∶200稀釋的M蛋白免疫兔血清(PBS為稀釋液)混合，混勻后加入M-GST蛋白(10 μg/mL)包被的酶標版，每孔50 μL，室溫，放置于微孔板震蕩器(QB-9001)，震速200，作用2 h；之后，PBST洗板5次，加入1∶4 000稀釋的HRP標記抗兔第二抗體，每孔50 μL，室溫孵育1 h；再次洗板，加入TMB底物顯色液，室溫避光15 min；讀取OD450值。同時，設置未混合sdAb-Mcs的兔血清對照組。競爭率計算公式為：競爭率=(兔血清孔OD450值-兔血清與sdAb-Mcs混合孔OD450值)/兔血清孔OD450值× 100%。

1.2.7 對M蛋白捕獲特性分析 用碳酸鹽包被緩沖液稀釋重組單價和雙價sdAb-Mcs至20 μg/mL，每孔50 μL，4 ℃，過夜包被酶標版；然后，用PBST洗板5次，用BSA-PBS封閉緩沖液室溫封閉1 h；再次洗板5次，拍干孔內殘留液體，加入質量濃度為0.1 g/L的重組M蛋白，每孔50 μL，室溫，震蕩孵育2 h，吸出孔內液體，用Nanodrop 2000 測蛋白質量濃度，計算質量濃度變化值，比較分析不同sdAb-Mcs結合M蛋白的差異。用t-test 統計學方法分析單價與雙價抗體捕獲M蛋白的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 PEDV特異性sdAb結構模擬及雙價抗體表達質粒構建

結構模擬分析結果顯示，sdAb-Mc19、sdAb-Mc29、sdAb-Mc30和sdAb-Mc37與已報道的雙峰駝源sdAb 5lz0具有相似的空間結構，僅在CDR3結構域存在一些差異(圖1-a)。

利用這些sdAb-Mcs按照圖1-b所示的方式，構建含雙拷貝sdAb-Mcs基因的原核表達質粒PET-32a-sdAb-Mc19-19 /29-29 /30-30 /37-37，測序分析連接目的基因片段正確后，提取質粒，備用。

2.2 雙價sdAb的表達、純化與鑒定

將表達質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞(DE3)，用0.001 mol/L的IPTG 誘導，SDS-PAGE結果，IPTG誘導組出現大小約為40 ku的表達條帶，與目標蛋白大小相符；大量誘導收獲菌體，利用His標簽蛋白純化樹脂進行純化，可以得到預期大小的蛋白，進一步通過Western blot方法驗證，結果同樣出現預期大小的條帶(圖1-c)。

2.3 重組雙價sdAb-Mcs與M蛋白結合活性 分析

通過ELISA和Western blot 檢測重組雙價sdAb-Mcs與M蛋白的結合活性。ELISA結果顯示，M蛋白包被孔的OD450值隨著雙價sdAb-Mcs加入量增加而變大，而GST標簽蛋白包被孔的OD450值與空白對照孔值相近，并且隨著雙價sdAb-Mcs加入量增加OD450值沒有規律性變化(圖2-A)；Western blot 結果出現大小與M-GST相符的單一條帶，這些結果一致表明重組雙價sdAb-Mcs具有M蛋白結合活性。

2.4 溫度耐受性分析

將重組sdAb-Mcs置于30～90 ℃溫度梯度下1 h，用ELISA方法檢測在不同溫度條件處理，是否會影響這些sdAb-Mcs的M蛋白結合活性。結果顯示在30～70 ℃條件下，并沒有明顯影響這些抗體的結合活性，而在80 ℃處理后結合活性明顯下降，90 ℃處理后，基本失去M蛋白的結合活性(圖3)。此外，單價和雙價sdAb-Mcs展示了相似的溫度耐受性，表明構建雙價抗體并沒有影響sdAb-Mcs的溫度耐受性。

a. sdAb-Mcs的模擬結構，粉色、紅色和綠色分別表示CDR1、CDR2 和 CDR3，字母N 和C分別表示N端和C端 Homology modeling of sdAb-Mcs.CDR1, CDR2 and CDR3 are represented in purple, red and green，respectively,the N- and C-terminal extremities are labelled N and C, respectively; b. 雙價抗體的構建模式圖，利用BamHⅠ/HindⅢ和XholⅠ酶切位點，將雙拷貝的sdAb基因克隆到 pET-32a(+) 載體 Expression cassettes of bivalent sdAb-Mcs in pET-32a (+) vector,the sdAb-Mcs encoding gene is sub-cloned at theBamHⅠ/Hind Ⅲsite and theXhoⅠ Isite；c. 雙價抗體的表達、純化和Western blot 鑒定 Expression, purification, and verification of divalent sdAb-Mcs；1-4.分別為雙價抗體sdAb-Mc19-19、sdAb-Mc29-29、sdAb-Mc30-30和sdAb-Mc37-37的表達 Expression of sdAb-Mc19-19, sdAb-Mc29-29, sdAb-Mc30-30 and sdAb-Mc37-37；5.為空白質粒對照 Blank vector control；6-9.為sdAb-Mc19-19、sdAb-Mc29-29、sdAb-Mc30-30和sdAb-Mc37-37的純化 Purification of sdAb-Mc19-19, sdAb-Mc29-29, sdAb-Mc30-30 and sdAb-Mc37-37；10-13.分別為sdAb-Mc19-19、sdAb-Mc29-29、sdAb-Mc30-30和sdAb-Mc37-37表達的Western blot 鑒定 Verification by Western blot based on sdAb-Mc19-19, sdAb-Mc29-29 and sdAb-Mc30-30；M.為蛋白分子量標準 Protein molecular weight marker

圖1 sdAb-Mcs結構分析及雙價抗體的構建和表達
Fig.1 Structure of sdAb-Mcs cloning, expression and purification of bivalent sdAb-Mcs

2.5 pH耐受性分析

將這些重組sdAb-Mcs分別置于pH 2～11下，用ELISA方法，檢測不同pH對這些sdAb-Mcs的M蛋白結合活性的影響。結果顯示，在pH 2～10時，這些sdAb-Mcs均具備較好的M蛋白結合活性，而在pH為11時，結合活性明顯下降，在pH為2時表現出最佳的結合活性(圖4)。此外，單價和雙價sdAb-Mcs展示相似的pH耐受性，表明構建雙價抗體并沒有影響sdAb-Mcs的pH耐受性。

2.6 競爭活性分析

將不同量的單價和雙價sdAb-Mcs分別與M蛋白免疫的兔血清混合，通過ELISA方法，檢測這些sdAb-Mcs與血清中M蛋白抗體的競爭結合活性。結果顯示這些sdAb-Mcs均具備一定的競爭活性，并且與單價sdAb-Mcs相比，雙價sdAb-Mcs展示更高的競爭活性(圖5)。

A. 雙價sdAb-Mcs與重組 M蛋白及GST標簽蛋白的結合活性 The binding activity of bivalent sdAb-Mcs to recombinant M protein and GST-tag proteinwas analyzed; B. 驗證構建抗體與M蛋白的結合活性 The binding activity of bivalent sdAb-Mcs to recombinant M protein were verified by western blotbased on anti-His tag antibody

圖2 雙價sdAb的結合活性分析
Fig.2 Binding activity analysis of bivalent sdAb-Mcs to M protein

A.單價sdAb-Mc19和雙價sdAb-Mc19-19 在不同溫度條件處理后與M蛋白結合活性分析 The binding activity analysis of univalent sdAb-Mc19 and bivalent sdAb-Mc19-19 with M protein in different temperature condition by ELISA；B. sdAb-Mc29和sdAb-Mc29-29 Same analysis on sdAb-Mc29 and sdAb-Mc29-29 ；C. sdAb-Mc30和sdAb-Mc30-30 sdAb-Mc30 and sdAb-Mc30-30；D.sdAb-Mc37和sdAb-Mc37-37 sdAb-Mc37 and sdAb-Mc37-37

圖3 sdAb-Mcs溫度耐受性分析
Fig.3 Analysis of thermal tolerance of sdAb-Mcs

2.7 對M蛋白捕獲特性分析

將相同量的sdAb-Mcs包被酶標板，加入適量M蛋白，通過檢測M蛋白的質量濃度變化來分析這些sdAb-Mcs的抗原捕獲特性。結果在相同質量濃度的條件下，雙價sdAb-Mcs展示更好的M蛋白捕獲特性(圖6)。

3 討 論

抗體分子通過其穩定的構象結構來實現對抗原分子的特異識別與結合。常規抗體通過重鏈和輕鏈可變區的6個CDR形成構象來特異性識別抗原，而sdAb僅靠3個CDR就具備特異的抗原結合能力及高親和力，這可能與sdAb獨特的空間構象有關。sdAb展現出比普通抗體更長的CDR區，能形成更大的VH抗原結合環結構，并且具更長的CDR3，能夠形成更多的新結構，使抗體構象更為穩定[16]，從而補償VL缺失導致的抗原結合位點的缺乏。本研究以公布的雙峰駝源sdAb(5lz0)晶體結構為模板，對前期篩選的4株sdAb-Mcs進行結構模擬，分析發現4株sdAb-Mcs均與5lz0具有相似的空間結構，只是在CDR3區存在一些差別，表明這幾株抗體均具有結合抗原的sdAb特征性構象結構，是進行sdAb特性分析和應用研究的可靠材料。

A. 單價sdAb-Mc19和雙價sdAb-Mc19-19 在不同pH條件下與M蛋白結合活性分析 The binding activity analysis of univalent sdAb-Mc19 and bivalent sdAb-Mc19-19 with M protein in different pH condition by ELISA；B.sdAb-Mc29和sdAb-Mc29-29 Same analysis on sdAb-Mc29 and sdAb-Mc29-29；C.sdAb-Mc30和sdAb-Mc30-30 sdAb-Mc30 and sdAb-Mc30-30；D.sdAb-Mc37和sdAb-Mc37-37 sdAb-Mc37 and sdAb-Mc37-37

圖4 sdAb-Mcs pH耐受性分析
Fig.4 Analysis of pH condition tolerance of sdAb-Mcs

A. 單價sdAb-Mc19和雙價sdAb-Mc19-19 與M蛋白高免兔血清的M蛋白競爭結合活性分析 The competition capacity of univalent sdAb-Mc19 and bivalent sdAb-Mc19-19 to anti-M protein polyclonal antibody was analyzed by a competitive ELISA；B. sdAb-Mc29和sdAb-Mc29-29 Same analysis on sdAb-Mc29 and sdAb-Mc29-29；C. sdAb-Mc30和sdAb-Mc30-30 sdAb-Mc30 and sdAb-Mc30-30；D. sdAb-Mc37和sdAb-Mc37-37 sdAb-Mc37 and sdAb-Mc37-37

圖5 多克隆抗體競爭特性分析
Fig.5 Analysis of competition capacity to anti-M protein polyclonal antibody

* 表示P<0.05 * represent P<0.05

PEDV是威脅養豬業的重大病原，其傳播的廣泛性和對新生仔豬近100%的致死率，給養豬業帶來巨大損失。對PEDV的早期、快速、準確診斷對PED的防控和疫苗免疫具有重要指導意義。已有研究證實，通過構建多價抗體的方式能夠提高抗體的病原中和活性[17]。本研究已經利用篩選到的sdAb-Mcs建立PEDV檢測和分離的方法，并證實其適用于臨床樣品的病原檢測和分離[13]。為了建立更為高效的病原檢測和分離方法，本研究嘗試構建二價sdAb，旨在進一步提高這些抗體的病原親和特性，從而提高其應用潛力。

sdAb具有十分穩定抗原結合活性，即使經過鹽酸胍和尿素等蛋白變性劑處理后，仍然保持抗原結合活性，甚至有些sdAb還能耐受高達90 ℃的高溫變性處理，而常規抗體在70 ℃處理后就完全失去抗原結合活性[7, 18]。本研究將重組的單價與雙價sdAb-Mcs在30～90 ℃下處理，發現這些sdAb-Mcs在溫度高達80 ℃時仍能夠保持部分抗原結合活性，表明sdAb-Mcs具備sdAb所固有的溫度耐受特性。然而不同的是，sdAb-Mcs在90 ℃處理后，則完全喪失抗原結合活性，這可能與sdAb本身CDR3區域的氨基酸組成有關，由于CDR3較長，其內部的氨基酸，尤其是半胱氨酸，通過形成二硫鍵形成更為穩定的空間結構來增加sdAb的穩定性[16]。同時，比較單價和雙價sdAb的溫度耐受性發現，二者并沒有明顯的差異，表明構建二價抗體并沒有影響sdAb的溫度耐受特性。

隨著研究的不斷深入，sdAb在醫學領域得到廣泛關注。在作為口服治療性抗體藥物研發過程中發現，sdAb在空腸和胃液的條件下仍保持一定的結合活性[19]。在空腸和胃液條件下，sdAb除抵抗蛋白酶降解外，還要面臨極低的pH條件。本研究將重組sdAb-Mcs置于pH 2～11下，檢測其抗原結合活性，發現sdAb-Mcs在pH 2～10時均具備較好的結合活性，在pH 11時仍保持部分結合活性，而在pH 2時顯示出最佳的結合活性。這些結果表明，sdAb-Mcs具有較寬泛的pH耐受范圍，sdAb-Mcs能夠在極低pH下保持最佳的抗原結合活性，而在極堿性條件(pH 11)開始失去抗原結合活性。同時，比較單價和雙價sdAb-Mcs的pH耐受性發現，二者沒有明顯的差異，表明構建二價抗體沒有影響sdAb-Mcs的pH耐受特性。

為了比較分析單價與雙價sdAb-Mcs的抗原親和特性，本研究進行競爭ELISA和病原捕獲分析試驗。競爭ELISA結果顯示，二價sdAb-Mcs具有更高的M蛋白多克隆抗體競爭活性，表明二價sdAb-Mcs比單價sdAb-Mcs具有更高的抗原親和活性。病原捕獲試驗也證實二價sdAb-Mcs比單價sdAb-Mcs具有更高的病原捕獲活性。這些結果表明可以通過構建二價抗體的方式來提高sdAb的抗原親和性。

本研究發現構建二價抗體并沒有影響sdAb-Mcs的溫度和pH耐受性，并證實 sdAb-Mcs在30～70 ℃和pH 2～10 條件下，均具備較好的抗原結合活性；進一步分析證實，構建的雙價抗體具備更好的多克隆抗體競爭活性和抗原捕獲活性，這些結果表明構建二價抗體可以提高sdAb的抗原親和性；本研究為建立高度敏感和特異的PEDV檢測方法提供廉價的材料基礎，同時也為sdAb的有效應用提供更多思路。