富硒青錢柳蟲草片降血糖、免疫調節的實驗研究

李東山 呂 萌 譚開祥 向極釬 劉 衛*

（1 華中科技大學，湖北 武漢 430074；2 湖北思慧生物科技有限公司，湖北 恩施 445099；3 恩施州農業科學院，湖北 恩施 445099）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal） Ijinskaja），為我國特有的單種屬植物，早有古籍記載其枝葉具有清熱解毒等功效，民間多將其制成茶葉飲用。目前已有大量研究表明青錢柳具有降血糖、降血脂等功效[1-4]。硒是一種人體重要的微量元素。研究表明，硒具有提高人體抗氧化能力和改善免疫力等功效，適量補硒對于糖尿病的預防與治療具有重要意義[5-8]。有研究表明硒可以與青錢柳多糖結合形成硒多糖，且具有更好的降血糖作用[9]。發酵蟲草菌粉是通過分離天然蟲草菌株，進行深層發酵得到的。已有文獻報道，發酵蟲草菌粉與冬蟲夏草具有相同的功效成分，具有提高免疫力、抗腫瘤等多種功效[10-11]。我們采用恩施富硒青錢柳提取物復配發酵蟲草菌粉、枸杞提取物和茯苓提取物等功效成分制成壓片，旨在用富硒青錢柳提取物復配以蟲草菌粉為主的天然藥物活性成分能夠增強降血糖效果，并且提高藥物服用順應性。本文主要探討富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠血糖、抗氧化和免疫力的影響，為富硒青錢柳蟲草片的開發利用提供實驗依據。

1 材料與試劑

1.1 材料：富硒青錢柳葉由湖北恩施思慧生物科技有限公司提供，75℃蒸餾水提取2 h濃縮冷凍干燥得富硒青錢柳提取物。發酵蟲草菌粉、枸杞提取物、茯苓提取物購于杭州眾芝康菇生物技術有限公司。富硒青錢柳蟲草片規格為0.6克/片，根據相關專利設計配方[12]，主要成分為：富硒青錢柳提取物、發酵蟲草菌粉、枸杞提取物、茯苓提取物、輔料。片劑中硒含量為79.4 μg/g，腺苷含量為895 μg/g。

1.2 動物：4周齡，SPF 級雄性 C57BL/6 小鼠 65只，由湖北省疾病預防控制中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，實驗動物合格證號：42000600020649。普通維持料及高脂飼料由湖北省疾病預防控制中心提供。

1.3 試劑和儀器：消渴丸（廣州白云山中一藥業有限公司）；鏈脲佐菌霉素（阿拉丁試劑）；羅康全活力型血糖試紙（羅氏診斷產品（上海）有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

血糖儀（羅氏診斷產品（上海）有限公司）；318C 酶標儀（成都華衡儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 實驗分組及給藥：參考文獻方法[9,13]，小鼠適應性喂養后，禁食過夜后測定小鼠空腹血糖值，按照空腹血糖隨機分組。設置空白組（灌胃生理鹽水）、模型組（灌胃生理鹽水）、富硒青錢柳蟲草片低、中、高劑量組（給藥劑量根據人體推薦劑量換算得到，分別為0.185 g/kg、0.370 g/kg、0.740 g/kg），小鼠給藥劑量與人體推薦量換算參照文獻方法[14]，陽藥組（0.514 g/kg 消渴丸）作為陽性對照。分組后各組小鼠均為10只。實驗期間，空白組給普通飼料，其他各組給高脂飼料喂養。連續給藥42 d。

2.2 高血糖小鼠模型建立：參考文獻[13,15]，小鼠腹腔注射STZ溶液（以0.1 mol/L檸檬酸緩沖鹽溶液作為STZ 溶劑）損傷胰島細胞，聯合高脂飼料喂養建立高血糖小鼠模型。實驗小鼠連續給藥2周后，根據小鼠體質量腹腔注射40 mg/kg STZ 溶液，空白組腹腔注射溶劑。3 d 后，以同樣的步驟重復注射STZ溶液。

2.3 血糖與糖耐量的測定：末次給藥后，尾尖取血測小鼠血糖并計算糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）。小鼠禁食過夜，尾尖取血，測空腹血糖作為0 h血糖值。之后按體質量灌胃2.5 g/kg 的葡萄糖溶液，測量灌胃葡萄糖溶液后0.5 h、1 h、2 h的小鼠血糖，并計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）[16]。

2.4 血清指標的測定：糖耐量試驗后，全部老鼠換為普通飼料喂養。2 d后禁食過夜，摘眼球取血。全血離心分離血清，使用試劑盒測定血清中SOD、GSH-Px活力。

2.5 免疫器官指數的檢測：所有小鼠取血前稱取體質量，取血后將小鼠脫臼處死。解剖摘取脾臟記重，并計算臟器指數[17]。

2.6 數據統計分析：使用SPSS 19.0 軟件統計學分析實驗數據，結果以均值±標準差表示，組間多重比較采用LSD法。

3 結果與分析

3.1 富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠糖耐量的影響：末次給藥后測得小鼠血糖值并計算糖耐量，結果見表1。

由表1可知，糖耐量實驗中，模型組小鼠AUC顯著高于空白組（P＜0.01），證明糖尿病小鼠模型建立成功。相較于模型組，富硒青錢柳蟲草片中、高劑量組和陽藥組都具有顯著降低血糖的效果（P＜0.05）。并且富硒青錢柳蟲草片中、高劑量降血糖效果與陽藥消渴丸相當。低劑量組有下降趨勢，但無顯著性差異。

3.2 富硒青錢柳蟲草片對小鼠血清中GSH-Px、SOD活力的影響：SOD、GSH-Px是抗氧化系統中最重要的酶，在機體抗自由基損傷中起重要作用。連續給藥42d后，測定小鼠血清中GSH-Px、SOD活力。結果見圖1。如圖1所示，相比于空白組，其他各組SOD活力都有一定程度的降低，表明造模后小鼠血清SOD活力降低，陽藥消渴丸與富硒青錢柳蟲草片對SOD活力都無明顯改善效果。GSH-Px 檢測結果中，陽藥組和高劑量組GSH-Px活力相較于模型組也顯著升高（P＜0.05），且高劑量組效果優于陽藥組。同時富硒青錢柳蟲草片低劑量組、高劑量組和陽藥組GSH-Px活力相較于空白組都有顯著升高（P＜0.05）。

表 1 小鼠血糖和 AUC （x-±s）

圖1 小鼠血清 SOD 和 GSH-Px 活力測定結果比較

3.3 富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠免疫器官指數的影響：脾臟是動物體內重要的免疫器官，在脾臟中棲居著大量淋巴細胞和其他免疫細胞，脾臟指數在一定程度上能反映小鼠免疫功能的高低[17]。

圖2 小鼠免疫器官指數測定結果比較

如圖2 所示，陽藥組、中劑量組和高劑量組脾臟指數相較于空白組脾臟指數顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），且富硒青錢柳蟲草片提升糖尿病小鼠脾臟指數具有劑量效應。

4 結果與討論

糖尿病是一種由多病因引發的慢性內分泌代謝紊亂綜合征，糖尿病患者一般伴隨有免疫力低下，并患有各種并發癥。本文研制的富硒青錢柳蟲草片旨在發揮青錢柳降血糖效果的同時，結合微量元素硒和蟲草菌粉、枸杞和茯苓免疫力調節、抗氧化的作用，達到更好的降血糖、緩解糖尿病患者并發癥的效果。同時，片劑方便患者服用，利于提高服藥順應性。

本文通過腹腔注射STZ，以及長期喂養小鼠高脂飼料誘導建立糖尿病小鼠模型，連續給藥42 d對富硒青錢柳蟲草片進行功效評價。小鼠糖耐量試驗結果，顯示中劑量組、高劑量組具有顯著降血糖的效果。表明富硒青錢柳蟲草片具有顯著的降低糖尿病小鼠血糖的功效。

SOD、GSH-Px是機體內重要的抗氧化酶，實驗結果顯示造模后糖尿病小鼠SOD活力降低，但實驗結果表明富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠SOD活力無明顯改善效果。GSH-Px測定結果表明富硒青錢柳蟲草片可有效提高糖尿病小鼠GSH-Px 活力，其中高劑量組效果最為顯著。免疫器官脾臟指數實驗中，測定結果表明富硒青錢柳蟲草片高劑量組具有明顯的提高臟器指數的功效，其作用機制還有待深入研究。上述實驗結果表明，富硒青錢柳蟲草片在降低糖尿病小鼠血糖的同時，具有一定的免疫調節和抗氧化功效。