體積排阻色譜在蛋白質藥物聚集體領域的應用

張曉敏，胡志上，李紅梅*

(1.北京化工大學 生命科學與技術學院，北京 100029;2.中國計量科學研究院，北京 100013)

蛋白質藥物是目前銷售額最大的生物治療藥物[1]，蛋白質本身非常不穩定，其結構中非共價鍵的穩定性很容易被外力因素( 如搖動、溫度等)破壞。加熱、延長保存、有機溶劑、氧氣、pH值改變及其他多種因素均可引起蛋白質結構改變。作為蛋白質產品的蛋白藥，在生產過程中需要進行酸處理、熱處理和機械處理，這些過程中都有可能產生蛋白質折疊甚至聚集；蛋白藥在貯藏、運輸、銷售以及用藥過程中由于外力因素的作用也可能會產生聚集。蛋白質聚集現象會導致蛋白藥活性降低，藥品中的蛋白單體濃度降低，并可能產生有害的毒理學作用和免疫應答，甚至會發生危及生命安全的藥物反應[2]。

體積排阻色譜(Size exclusion chromatography,SEC)靈敏度良好、操作簡單、樣品前處理少、分析速度快、分離條件溫和[3]，自重組蛋白藥物誕生以來一直是蛋白質藥物聚集體表征的金標準[4-6]。蛋白質聚集體檢測技術經過多年發展，現已有20多種，常用聚集體檢測技術[7-10]如圖1所示。然而這些方法在檢測、定量聚集體方面均有一定的局限，如：動態光散射技術只能用作初步定性工具，沒有分離篩選能力；非對稱流場流、分析超速離心技術定量表征聚集體不如SEC準確；納米粒子示蹤技術僅適用于粒子濃度范圍為107～109顆/毫升(particles/mL)的蛋白質聚集體表征,為了達到合適的顆粒濃度通常需要對樣本進行稀釋，會對測量產生一定的干擾；光透法、流式成像技術在測量蛋白質樣品時容易受到折射率和稀釋倍數的影響，從而使測量結果不準確。綜上，SEC依舊是目前表征蛋白質藥物聚集體最常用的技術。該技術在監測蛋白質藥物的穩定性和降解模式方面發揮著重要作用，對于指導蛋白質藥物篩選及純化工藝的開發具有重要意義。本文介紹了SEC的分離原理并對其在蛋白質藥物聚集體檢測中的實際應用做了歸類,同時介紹了該技術在蛋白質藥物聚集體應用中存在的不足及優化方法，最后對其發展前景做了簡要概括。

圖1 檢測蛋白質大小(直徑)的方法及其檢測范圍[7]Fig.1 Methods for detecting protein size and its detection range [7]

1 體積排阻色譜原理

SEC根據流體動力學半徑(Hydrodynamic radius)分離大分子化合物，其固定相由嚴格控制孔徑的球形多孔顆粒組成，大分子化合物根據其分子體積大小差異以水性緩沖液作為流動相進行擴散[4]。Engelhardt等[6]提出以保留因子k*作為溶質在孔內滯留流動相與顆粒間流動相的比。在SEC中，該k*值是有限的，其最大值由色譜柱的孔體積(VP)和粒間孔體積(VZ)的比值給出:

(1)

(2)

式中，Velu代表從進樣開始計算的通過色譜柱的實際淋洗體積。對于給定的色譜柱，其最大值k*是固定的，隨著分子量增加，分子體積相應增大，溶質流經的總孔體積減少，進而導致峰展寬。目前最先進的色譜柱的最大保留因子k*約為1.6～1.8。通過引入k*，Engelhardt得出了以下半經驗關系來描述色譜柱性能：

(3)

其中，H為板高；dP為粒徑；DM為分子擴散系數；u為流動相線速度。

一般對于液相色譜，兩組分的分離度為：

(4)

其中，tR,j、tR,i分別為兩組分的保留時間；wi、wj為兩組分對應的峰寬。

在SEC中由于H與u有關或與其保留體積VR有關，上述R的概念不完全適用，故引入

(5)

其中，ΔVR(ΔVR=VR,i-VR,j)為兩組分保留體積之差；σ為標準偏差(與峰寬成正比)；Mi、Mj為兩組分的分子量(Molarmass),且Mi>Mj。當兩組分的分子量差一個數量級(Mi=10Mj)時,認為兩個分離度是相等的。

通常流速越低，其分離效果越好，同時分析時間越長。一般可以通過減小固定相粒徑、減少色譜柱長度以及增加流速來縮短分析時間[4]。已有研究報道了柱長和流動相流速對SEC分離的影響。Popovici等[11]以1 mg/mL的四氫呋喃為流動相，聚苯乙烯混合物為樣本，考察了流速為0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/min時對其分辨能力的影響，結果顯示0.3、0.5 mL/min流速下的分離效果最好，當增加流速時分辨率下降，分析時間減少，且當流速大于1.0 mL/min時其分辨能力下降更快。Ricker等[12]使用ZorbaxGF-250色譜柱(250 mm×9.4 mm)研究流速對SEC分辨能力的影響時也得出相同結論，且增加色譜柱長度，分辨能力增加，因此優化SEC方法時需要綜合考慮分辨率以及分析時間。

2 SEC在蛋白質藥物聚集體檢測中的實際應用

SEC原理簡單、操作方便、靈敏度良好，常被用于質量控制[2],是評估聚集體形成的標準技術之一，在實際使用中常與多種檢測器聯用，如UV、RI(示差折光檢測器)、多角度光散射(MALS)和粘度計等。SEC可以通過得到準確的分子量以及洞察與聚集相關的降解途徑和產物來增強蛋白質表征[13],如Kiminami等[14]通過SEC聯用紫外、多角度靜態光散射(SEC-UV-MALS)技術評估了滅菌方法對聚合物基注射器中促紅細胞生成素(EPO)儲存穩定性的影響。Lancaster等[15]使用SEC聯用光散射、紫外、示差折光檢測(SEC-HPLC-MALS-UV-RI)的方法來表征針對艱難梭菌疫苗(Clostridium difficile vaccine)的4種不同蛋白質抗原的聚集水平。SEC聯用紫外、質譜檢測器(Native SEC-UV-MS)還可以表征低豐度和非共價蛋白質尺寸變體，并且為分析混合抗體藥物的物理(聚合)和化學(共價修飾和碎裂)降解過程、研究抗體-抗原相互作用和其他主要類別的生物藥物如Fc融合蛋白和蛋白質支架提供強大的平臺[16]。SEC在監測蛋白質藥物的穩定性和降解模式方面發揮著重要作用，同時也被用來研究蛋白質藥物的聚集機制。

2.1 在蛋白質藥物穩定性方面的應用

Al-Ghobashy等[17]將SEC作為一種技術手段研究了pH值對蛋白質藥物穩定性的影響，結果表明蛋白質藥物的降解與溶劑的pH值有關，在較低pH值時蛋白質藥物降解程度最低。抗體藥物偶聯物(Antibody-drug conjugate,ADC)將單克隆抗體的特異性靶向特性與小分子藥物的極高效能相結合[18-19]，是復雜的蛋白質藥物治療劑。ADC由3部分組成：單克隆抗體、細胞毒性藥物以及將抗體和小分子藥物連在一起的接頭。Li等[20]將SEC與在線二維色譜中的反相色譜(RP-HPLC)聯用，用于ADC藥物制劑在不同溫度和配方pH值下穩定性的研究。該技術可直接在ADC樣品中鑒定和定量未結合的小分子藥物和相關的小分子雜質，其中SEC方法在第一維不僅能將小分子雜質與完整的ADC分開，而且還能提供關于ADC的尺寸(單體、二聚體、多聚集體等)二維信息。

2.2 在抗體包裝產品穩定性檢測中的應用

長久以來，藥物注射器大部分采用玻璃制成。已有研究表明玻璃注射器潤滑所需的硅油會引起某些蛋白質(包括蛋白質藥物)的聚集[21-23]，目前其與蛋白質的相互作用仍然是一個熱門研究領域。Felsovaly等[24]發現來自針筒的硅油滴會干擾蛋白質聚集體的定量和表征。SEC作為檢測蛋白質聚集體的常用技術，被用于預填充注射器以及其他抗體藥物包裝中蛋白質藥物穩定性的研究。如Waxman等[25]運用SEC作為其中一種技術手段研究幾種蛋白質樣品在靜態條件下和受到機械應力刺激時存儲在由硅化玻璃以及無硅塑料制成的預填充注射器中蛋白質的穩定性。結果表明無硅塑料制成的注射器中蛋白質聚集體更少。Sugimoto等[26]在評估外部配藥藥房用一次性玻璃瓶和玻璃安瓿瓶中重新包裝的Avastin?(貝伐單抗)的穩定性和功效研究中，使用SEC來定量重新包裝的貝伐單抗樣品單體和可溶性聚集物水平，結果表明貝伐單抗在安瓿瓶和一次性玻璃瓶中復配后保持穩定，沒有觀察到顯著的聚集、片段化或生物活性喪失。

2.3 聚集機制研究

SEC作為一種技術手段也被科研人員用來研究蛋白質的聚集機制。Xiong等[27]在研究阿爾茨海默病相關的Aβ(β-淀粉樣蛋白)肽Aβ(25～40)的聚集機制中將SEC作為其中一種技術手段，評估樣品的初始聚集體分布。Paul 等[28]通過SEC技術發現4號單抗株(mAb4)及其Fab片段的霧化導致其單體含量顯著降低，Sadavarte等[29]在研究中采用SEC和疏水相互作用膜色譜確定單克隆抗體寡聚體解聚的程度,結果顯示熱循環導致樣品二聚體分解。

3 SEC在蛋白質藥物聚集體分析中存在的不足及優化方法

SEC方法靈敏度良好、重復性強、檢測速度快，在蛋白質藥物聚集體分析中得到了廣泛使用。但其在實際應用中仍存在一定的不足，主要表現為蛋白質藥樣品與SEC固定相之間的非特異性相互作用[30]會導致洗脫延遲，色譜峰拖尾，基線漂移，蛋白質回收率低等問題，其次，由于SEC檢測范圍有限，而蛋白質藥物形成的聚集體尺寸范圍較大(從簡單的二聚體到可以被SEC色譜柱過濾掉的大的多聚體),導致檢測結果不準確。以下將針對這兩個問題做簡要探討。

SEC用于蛋白質藥物分析時，蛋白質藥物聚集體比單體更容易與柱基產生非特異性相互作用，導致分析不準確、可能檢測不到對產品安全性或功效有顯著影響的聚集體[31]。通常，新的SEC色譜柱會更容易吸附蛋白質,且初次進樣會比多次進樣吸附蛋白嚴重。其次，蛋白質藥物的配方即溶劑和SEC流動相并不完全適配，當蛋白質藥樣品被注入與其成分不同的流動相時，會增加蛋白質樣品與SEC柱的非特異性吸附，也會對其非共價聚集體的分布造成一定的干擾，導致測量不準確。因此選擇合適的流動相以及低吸附的色譜柱對于SEC方法優化是必須的。

但隨著SEC色譜柱填料的發展，一些研究表明，在采用新型填料時，蛋白質樣品與柱基的非特異性相互作用基本可以忽略。如Goyon等[32]在研究鈉、鉀添加劑對SEC分離蛋白質藥物與聚集體的影響時，分別采用了安捷倫公司(Agilent Technologies)的AdvanceBioSEC色譜柱、日本Tosoh(Tokyo,Japan)公司的TSKgel UP-SW3000色譜柱以及美國Waters(Milford,MA,USA)的ACQUITY UPLC BEH200色譜柱，通過SEC耦合在線熒光光譜法測定，發現10個商業單克隆抗體的聚集水平在3個不同的UHP-SEC柱上相似，表明3個SEC色譜柱填料對蛋白質藥物聚集體影響低，其非特異性相互作用可以忽略不計。因此本文側重于討論流動相的優化。

3.1 流動相的優化

一般情況下，流動相低到中的鹽濃度可降低蛋白質藥物樣品與SEC固定相的相互作用，使蛋白質樣品洗脫時間正常且回收率提高，高濃度鹽則會導致蛋白質鹽析。如Kamberia等[33]使用TSK-G2000SW色譜柱以人甲狀腺激素(Human parathyroid hormone,hPTH)(1～34)為樣品分析了NaCl濃度對樣品非共價聚集體回收率的影響。結果表明,增加鹽濃度且當NaCl為100 mmol/L時，其回收率達到最大(78.2 %)，NaCl為600 mmol/L時,由于鹽析，樣品回收率降為0。Ricker等[12]使用ZorbaxBioSeries GF-250(250 mm×9.4 mm 或 250 mm×4.6 mm)色譜柱研究了不同鹽濃度流動相對3種抗體的影響，其中3種抗體最佳鹽濃度為0.1～0.2 mol/L，當鹽濃度<0.1 mol/L時，樣品回收率快速增加，鹽濃度為0.1～0.4 mol/L時達到平緩，當鹽濃度大于0.4 mol/L時回收率快速降低。保留時間在該鹽濃度范圍內無顯著變化。

氨基酸在遠紫外區均有光吸收，目前很少用于SEC流動相中，但一些研究表明氨基酸可以減少或抑制蛋白質樣品與硅膠柱基的非特異性相互作用，如精氨酸。Yumioka等[34]使用兩根新的TSKgel G3000SWXL色譜柱，分別以pH 6.8的0.2 mol/L NaCl緩沖液以及0.2 mol/L(arginine HCl)精氨酸緩沖液為流動相，對比了鼠源抗體mIgG1在相同流速、相同進樣量條件下的分離度以及回收率。結果表明，在精氨酸緩沖溶液中蛋白樣本單體和二聚體的分離度優于氯化鈉緩沖溶液(精氨酸緩沖溶液中樣品單體和二聚體分離度為1.36，氯化鈉緩沖溶液中為1.25)，同時該樣品在精氨酸緩沖溶液中的回收率優于氯化鈉緩沖溶液中，該研究還發現樣品在精氨酸緩沖溶液下的聚集體含量顯著高于氯化鈉緩沖溶液。

加入去垢劑也可以抑制蛋白樣品與固定相的相互作用，但由于去垢劑會與蛋白樣品結合，可能破壞蛋白樣品的非共價聚集體，所以一般很少在SEC分析蛋白質藥樣品[31]中使用。微量的去垢劑是否可以在不破壞非共價聚集體的情況下抑制蛋白樣品與柱基的吸附作用還有待進一步研究。

3.2 檢測范圍難以覆蓋整個蛋白質聚集體

蛋白質藥物聚集體通常被認為是產品降解產物，尺寸范圍包括納米級的二聚體以及數百微米肉眼可見的顆粒[35]。聚集是影響蛋白質藥物安全性和功效的重要問題，并與蛋白質免疫原性有關[7]。因此需要準確定量表征蛋白質聚集體以滿足臨床要求。SEC由于自身條件，如色譜柱填料、色譜柱長等導致檢測范圍存在一定限制，為了確保該技術檢測蛋白質藥物聚集體的可靠性以及準確性，本文提出幾種常用的檢測手段，作為SEC驗證時的補充技術。

3.2.1 與聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)技術聯合使用SDS-PAGE是一種非常常見、相當穩健的方法，該方法操作簡單，可以提供樣品近似分子量和數量信息。SDS的存在意味著非共價聚集體被破壞，所以該方法僅可檢測共價聚集體。如果使用還原條件，SDS-PAGE可以區分由二硫鍵連在一起的聚集體和由其他(不可還原的)共價鍵連在一起的聚集體。目前SDS-PAGE正在被更適合量化的毛細管電泳CE-SDS所取代。使用CE-SDS可以自動運行樣品并通過紫外吸收而不是染料結合進行定量，實現與SDS-PAGE類似的結果。SEC和SDS-PAGE和/或CE-SDS的組合通常是質控分析的一部分[2]。如Turner等[36]使用SEC、CE-SDS、動態光散射(DLS)以及流式成像技術(FI)等技術對NIST單克隆抗體進行大小變異體監控，其中優化過的CE-SDS以及SEC技術可涵蓋大小約為100 nm及以下的大小變異體，在監視抗體結構、純度及穩定性方面發揮了重要作用。Dada等[37]對比了SEC與CE-SDS技術在監測IgG1單克隆抗體降解中的應用，研究表明CE-SDS可作為SEC在監測抗體鉸鏈區片段化中的替代技術，同時兩種技術相結合可以獲得抗體片段化較為全面的表征。Buecheler等[38]在其研究中采用SEC與非還原狀態下的SDS-PAGE技術檢測釀膿鏈球菌來源的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes,IdeS)對IgG1單克隆抗體的消化速率，結果表明使用IdeS幾乎可以使該實驗中IgG1單克隆抗體完全消化(消化蛋白量> 98%)。

3.2.2 與分析超速離心法(Analytical ultracentrifugation,AUC)技術聯合使用AUC是表征大分子沉降行為和溶液中聚集體存在的有力技術，主要應用沉降速度模式(SV-AUC)。AUC的主要優點之一是蛋白質樣品通常可以在其樣品緩沖液中無需樣品前處理進行表征。減少了由樣品制備、稀釋或基質效應引起的樣品中聚集體的形成或破壞。由于沒有目標分子與色譜柱或膜的相互作用，AUC是定性交叉核對或檢驗由SEC 獲得數據準確性的有利工具[2]。 AUC可用于驗證樣本中可能存在的聚合類型是否被SEC漏掉。Philo[9]發現用SEC檢測的單體峰如果用SV-AUC分析,則包含單體和二聚體。Gervais等[39]將AUC與SEC技術聯合使用，在對堿性蛋白質高聚物進行定量分析的過程中發現，SEC方法開發中應評估堿性蛋白質與柱基的非特異性結合作用，以確保對較大聚集物的分辨能力不受影響。

3.2.3 與動態光散射(DLS)技術聯合使用DLS(Dynamic light scattering)是一種用于測定粒徑在1～2 nm到3～5 μm范圍內粒徑分布的非破壞性技術[2]。該技術一般用于蛋白質藥物穩定性研究。Al-Ghobashy等在SEC與DLS技術檢測pH值對生物制藥穩定性影響的研究中，使用DLS技術觀察到了SEC色譜圖中未觀察到的高分子聚合物的存在[17]。

3.2.4 與流場流分離(Flow field-flow fractionation(F4))技術聯合使用F4最近已被美國食品藥物管理局(FDA)批準為蛋白質產品驗證中SEC的補充技術[40]，其小型化中空纖維流場分離(Hollow fiber flow field-flow fractionation，HF5)技術顯示了以下優點：檢測范圍較寬、分離機理溫和、稀釋倍數低和靈敏度高。為此Marassi等[40]提出將HF5作為評估單克隆抗體樣品中聚集體含量的補充技術，并對SEC和HF5性能進行了比較研究，證明了SEC和HF5之間的互補性以及它們被用作蛋白質藥物表征和質量控制方法的可行性。

3.2.5 與其他多種方法聯合使用SEC靈敏度高、操作簡單、樣品前處理少、分析速度快、分離條件溫和[3]，自重組蛋白藥物誕生以來一直是蛋白質藥物聚集體表征的金標準。然而在實際應用過程中仍存在由于蛋白質與固定相的非特異性相互作用所導致的洗脫延遲、色譜峰拖尾、基線漂移、蛋白質回收率低等問題。其次，由于該技術分離大分子化合物的尺寸范圍有限，而蛋白質聚集體大小范圍包括納米級的二聚體以及數百微米級的肉眼可見顆粒，因此需要結合多種技術來獲得有關蛋白質聚集體形成方式及其結構、大小等的全面信息。He等[41]開發了SEC與混合模式液相色譜(LC)在線偶聯的方法，該方法允許同時測量蛋白質藥物中各種組分，包括活性藥物成分(蛋白質)和各種賦形劑，如陽離子、陰離子、非離子疏水表面活性劑和親水性糖類等。Li等[20]開發了一種使用SEC和RP-HPLC二維色譜模式的技術，用于直接分析抗體藥物偶聯物(Antibody drug conjugates,ADC)中的游離藥物和相關小分子雜質。近年來不斷涌現的分析儀器及方法也為SEC與其他多種方法聯合使用，從而實現蛋白質聚集體全面表征提供了可能。如Hu等[42]在實驗室搭建了一款新的流式細胞儀(FC,Flow cytometry)，該儀器可以輕松檢測低至200 nm左右的標準聚苯乙烯微球以及微米級別的二氧化硅顆粒，通過該儀器對比不同加熱時間、加熱溫度下單克隆抗體的聚集情況，結果表明該儀器可以檢測到大小為0.2～10 μm的蛋白質聚集體，該技術為蛋白質聚集體表征技術的選擇提供了新的參考。Yoneda等[43]比較研究了定量光散射技術(Quantitative laser diffraction,qLD)與共振質量測量技術(Resonant mass measurement,RMM)、納米粒子示蹤技術(Nanoparticle tracking analysis,NTA)、流式成像技術(Flow imaging,FI)以及光透法(Light obscuration,LO)在蛋白質聚集體定量表征中的應用，發現qLD和RMM 在粒徑范圍0.3～2 μm之間時數據具有良好一致性，同時qLD與FI技術在粒徑范圍2～20 μm之間時數據具有良好一致性，從而為蛋白質聚集體表征技術的組合提出了新方法。

4 結語與展望

綜上所述，SEC目前仍然是蛋白質藥物開發、質量控制和穩定性研究中最常用的方法。該技術適用于1～50 nm范圍內聚集體的分析。當不引起樣品聚集狀態的變化且可消除與柱填充介質的非特異性相互作用時，SEC被認為是穩健且準確的。