基于銅摻雜碳納米點熒光測定炭疽生物標志物

華 鵬，黃 玉，周 陽，何繁漪，楊瓊暉，朱為梅

(云南省第三人民醫院，云南 昆明 650011)

細菌芽孢是產芽孢桿菌在孢內形成的一種休眠體，對環境具有極強耐受性。炭疽芽孢是芽孢桿菌中的一種能致炭疽熱的危險病原體，人類可通過食用或者吸入炭疽熱芽孢，皮膚接觸被感染的動物，或者吸入已被細菌污染的物質而被感染[1-2]。炭疽芽孢桿菌曾作為生化武器嚴重威脅人類的生命健康，所以準確和靈敏地檢測炭疽芽孢對于預防和控制生物攻擊及疾病爆發十分重要[3-4]。2,6-吡啶二甲酸(Dipicolinic acid,DPA)是炭疽芽孢中的特有成分，約占芽孢干重的5%～15%，可通過孢子的物理、化學裂解或者萌芽等方式釋放。因此，DPA可作為炭疽芽孢桿菌中重要的生物標志物用于炭疽芽孢的檢測[5-6]。近年來，炭疽芽孢桿菌的光學測定方法主要是利用鑭系金屬元素熒光傳感對其中的DPA進行檢測[7-8]，但是，鑭系金屬元素成本高，當DPA濃度較低時熒光比色不明顯。因此，發展低成本且具備高靈敏度、高選擇性、低檢出限的DPA檢測方法仍是研究熱點。

熒光碳納米點(CDs)是一種尺寸小于10 nm，以碳為基本骨架，表面含有大量含氧基團的單分散類球形納米顆粒[9-10]。與傳統有機染料及半導體量子點相比，熒光碳納米點不僅具有光學性質穩定、易于表面功能化和大規模制備等優勢，還具有生物相容性好和細胞毒性低等特性[11-12]，在體內外活體生物成像、熒光標記、藥物傳輸、熒光探針等領域有著廣泛的應用前景[13-15]。近年來，有大量關于摻雜碳納米點的合成、性質和應用方面的研究報道，其中，金屬摻雜能夠在很大程度上改變碳納米點的電荷密度、光學及物理化學性質，從而拓展其應用范圍[16-17]。

本研究以檸檬酸、乙二胺為前體，硫酸銅為金屬摻雜劑，采用一步水熱法制備了一種穩定的水溶性藍色發光銅摻雜碳納米點(Cu-CDs)，并基于酸性條件下DPA分子與銅離子產生的強螯合作用，實現了該Cu-CDs對DPA的特異性識別檢測。本方法操作簡單、靈敏度高、成本低，可用于炭疽生物標志物的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

G9800A熒光分光光度計(美國安捷倫公司)，Tecnai G2TF30場發射透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)，X-射線光電子能譜儀(XPS，賽默飛世爾科技公司)，TENSOR27型傅立葉紅外光譜分析儀(德國Bruker公司)，UV-2600紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，Scilogex-MX-S漩渦混勻儀(北京開源國創科技有限公司)，120 mL聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)內襯水熱反應釜(鞏義市予華儀器有限責任公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

2,6-吡啶二甲酸標準品(DPA，純度>99%)購于Sigma-Aldrich(上海)有限公司；苯甲酸、鄰苯二甲酸等有機小分子物質以及六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)等無機鹽干擾物均購自上海阿拉丁試劑有限公司；乙二胺、檸檬酸和磷酸氫二鈉(Na2HPO4)等試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。所用化學藥品及試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 銅摻雜碳納米點(Cu-CDs)的制備準確稱取3.0 g檸檬酸和2.0 g 硫酸銅溶解于97 mL的超純水中，超聲10 min形成淺藍色溶液，再加入3 mL乙二胺攪拌均勻，將溶液轉移至聚四氟乙烯內襯水熱反應釜中，于180 ℃下恒溫加熱5 h，反應完成后自然冷卻至室溫，得到褐色溶液。將所得溶液過0.22 μm濾膜以除去大顆粒雜質，然后用截留分子量為3 500 D的透析袋透析處理24 h，得到水溶性銅摻雜碳納米點(Cu-CDs)，并儲存于4 ℃下備用。

1.2.2 量子產率的測定將碳納米點配制成溶液后，測試其紫外-可見吸收光譜及熒光光譜(λex=350 nm)。將熒光強度值I及相應的吸光度A(λem=440 nm)代入公式Φx=ΦR(nx/nR)2(AR/Ax)(Ix/IR)。式中，x為測試樣品，R為標準物質；Φ表示熒光量子效率，n表示溶劑的折光率。實驗中以硫酸奎寧(熒光量子效率為54%)作為標準物[18]。

1.2.3 測定方法稱取適量DPA，用超純水溶解，配制成不同濃度系列的DPA溶液。將上述制備好的Cu-CDs稀釋至2 mg/L，取Cu-CDs稀釋液1 mL于5 mL離心管中，加入不同濃度的DPA儲備液100 μL，用pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L)定容至3 mL，渦旋混勻，靜置2 min，于激發波長λex=348 nm，發射波長λem=442 nm處測定熒光強度IF和試劑空白溶液熒光強度IF0。

2 結果與討論

2.1 碳量子點的合成與表征

本實驗以硫酸銅作為銅摻雜的反應前體，經一步水熱法制備了高熒光量子產率的水溶性Cu-CDs。圖1A為Cu-CDs的透射電鏡圖(TEM)，從圖中可以看出，所制備的碳納米點呈類球形結構，分散性好，粒徑均勻，平均尺寸2～3 nm左右。

2.2 測定原理

如圖3所示，由于Cu-CDs中含有大量的銅摻雜離子，而DPA分子的羧基和吡啶氮是結合銅離子的作用位點，在酸性條件下，該作用位點能與銅離子產生較強的螯合作用。因此，在酸性體系中，當在Cu-CDs溶液中加入DPA之后，Cu-CDs能與DPA分子迅速反應，DPA分子通過與銅離子之間的螯合作用穩定地結合在Cu-CDs表面上。這一螯合體系增強了Cu-CDs的π-π*共軛吸收，同時改變了熒光產生過程中的能級躍遷，在相同的激發波長下，體系熒光發射波長出現紅移，因此，隨著DPA濃度增大，熒光紅移現象逐漸明顯，Cu-CDs的藍色熒光將逐漸減弱[19]。

圖3 銅摻雜碳納米點檢測DPA的原理示意圖Fig.3 Schematic illustration of the Cu-CDs for DPA detection

圖4 體系的選擇性實驗Fig.4 Selectivity of fluorescence system1-15：0.15 μmol/L DPA;6 μmol/L of glucose,vitamin C,citric acid,sucrose,benzoic acid,phthalic acid,isophthalic acid,terephthalic acid,nicotinic acid,phenylalanine,cysteine,tryptophan,serine,the mixture of 0.15 μmol/L DPA with 6 μmol/L of different organic small molecules,respectively

2.3 反應條件的優化

2.3.1 pH值本實驗選用50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液作為緩沖體系，考察了pH值在2.0～8.0范圍內對體系熒光強度的影響。結果發現pH 6.0時對體系熒光強度變化值的影響最大，故本實驗選擇 pH 6.0為最佳反應pH值。

2.3.2 反應時間研究了反應時間對熒光猝滅體系的影響。連續測定10 min，每隔1 min測定一次體系熒光強度變化值。結果顯示，體系熒光強度變化值在1～3 min內逐漸增加，隨后趨于穩定，故選擇3 min為最佳反應時間。

2.4 體系對DPA的選擇性

2.5 體系對DPA的響應

在優化實驗條件下，考察了Cu-CDs熒光猝滅程度與DPA濃度之間的關系。由圖5A可以看出，隨著DPA濃度的增加，Cu-CDs的熒光強度逐漸減弱且光譜逐漸向綠色波長移動。DPA濃度(c)分別在5～100 nmol/L和150～400 nmol/L范圍內與Cu-CDs熒光猝滅率(IF0-IF)/IF0(y)呈線性關系，線性回歸方程分別為y=0.005 5c+0.001 6和y=0.000 5c+0.572 3，相關系數分別為r2=0.994 1和r2=0.997 6，檢出限達2.3 nmol/L(S/N=3)。如圖5B所示，當向Cu-CDs溶液中加入不同濃度的DPA時，隨著DPA濃度的增加，溶液在365 nm紫外燈下的顏色逐漸由藍色變為綠色，故該探針可進行比率測定。

2.6 實際樣品測定

選取河水、自來水、牛奶以及小牛血清為分析對象，水樣先用0.22 μm濾膜過濾，再在15 000 r/min下離心10 min除去懸浮的大顆粒雜質；牛奶經蛋白質等電點沉淀法除去蛋白，取上清液過0.22 μm濾膜；10%的小牛血清無需處理。每個樣品平行測定5次，結果如表1所示，其加標回收率為95.2%～105%，RSD為1.3%～3.8%。

表1 實際樣品中DPA含量的測定結果(n=5)Table 1 Analytical results for DPA in real samples by the proposed method(n=5)

3 結 論

本研究制備了一種高穩定性、高熒光量子產率的水溶性銅摻雜碳納米點(Cu-CDs)，基于炭疽芽孢生物標志物2,6-吡啶二甲酸(DPA)與碳納米點中Cu2+的強螯合作用對Cu-CDs的藍色熒光猝滅及熒光顏色變化，建立了銅摻雜碳納米點比率測定炭疽生物標志物的新方法。在最優條件下，方法的檢出限達到2.3 nmol/L。該分析方法專屬性強、靈敏度高、操作簡便，成本較低，具有良好的應用前景。