基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)快速解析杜仲顆粒化學(xué)成分

馬永青，王 璐，劉 穎，李欣欣，劉永利*

(1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011；2.河北省食品藥品審評認(rèn)證中心，河北 石家莊 050011；3.中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

杜仲顆粒執(zhí)行國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS3-B-1938-95)，由杜仲和杜仲葉飲片組成。該方具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎和降血壓的作用，可用于治療腎虛腰痛、腰膝無力、胎動不安、先兆流產(chǎn)和高血壓癥。杜仲與杜仲葉飲片均收載于《中國藥典》2015年版，兩者具有相似的化學(xué)成分和藥理作用[1]。目前，關(guān)于杜仲顆粒的研究僅限于藥材鑒別和少數(shù)成分的含量測定[2-4]，對于中藥制劑中化學(xué)成分的鑒別鮮有報(bào)道。中藥的有效性是中醫(yī)治療的優(yōu)勢，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清是阻礙中藥發(fā)展的關(guān)鍵問題。杜仲顆粒含有多種活性成分，僅掌握少數(shù)化學(xué)成分不能全面控制其質(zhì)量、反映臨床療效，因此有必要建立一種全面分析杜仲顆粒化學(xué)成分的快速、靈敏的方法。

超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)是基于LTQ的多級質(zhì)譜功能及Orbitrap高分辨能力的一種分析方法[5-6]，具有高靈敏度、高分辨率和精確相對質(zhì)量測定等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于缺乏對照品的中藥復(fù)雜體系定性鑒定及新化合物發(fā)掘。本研究利用LTQ-Orbitrap-MS負(fù)離子模式采集，各成分的一級全掃描離子在離子阱內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離(CID)模式的多級質(zhì)譜分析，與傅立葉變換靜電場軌道阱(FT Orbitrap)提供的高分辨質(zhì)譜信息相結(jié)合，既實(shí)現(xiàn)了UPLC技術(shù)對復(fù)雜成分快速分離的優(yōu)勢，又能獲得高分辨質(zhì)譜信息，達(dá)到快速分析鑒定未知成分。采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS建立了杜仲顆粒化學(xué)成分的綜合定性分析方法，并對各成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行總結(jié)，為深入闡述其藥效物質(zhì)和建立質(zhì)量控制體系提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備Dionex UltiMate 3000 UPLC儀，LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；電子分析天平(Mettler XPE 26型，瑞士Mettler Toledo 公司)；數(shù)控超聲波清洗器(Elmasonic P300 H型，德國Elma公司)；超純水儀(美國Millipore公司)。

京尼平苷酸(批號：111828-201403)、綠原酸(批號：110753 -201415)、松脂醇二葡萄糖苷(批號：111537-201706)、梓醇(批號：110808-200407)、咖啡酸(批號：110885-200102)，購于中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號：17042715)購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色譜純，Merck KGaA公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。杜仲顆粒樣品由生產(chǎn)廠家提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備供試品溶液：將杜仲顆粒研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加25 mL甲醇，超聲處理30 min，放冷，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

對照品溶液：取京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、梓醇、咖啡酸和紫云英苷對照品，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，制備單一對照品儲備液。

1.2.2 UPLC-LTQ-Orbitrap分析條件色譜柱為Thermo Scientific Syncronis C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～35 min，5%～70%乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

圖1 杜仲顆粒的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Duzhong granulesthe peak numbers denoted were the same as those in Table 1

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式檢測，噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣流速為35 L/min，輔助氣流速為10 L/min，毛細(xì)管溫度為300 ℃，離子源溫度為350 ℃。鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?純度>99.99%)，碰撞氣為高純氦氣；采用傅立葉變換高分辨全掃描方式(Full scan)，分辨率為60 000，質(zhì)量掃描范圍m/z50～2 000；多級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴式掃描(Dependent scan)，CID模式，碰撞能為35%。

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲顆粒化學(xué)成分的鑒定與分析

取杜仲顆粒樣品，將供試品溶液按“1.2.2”分析條件進(jìn)行測定，得到負(fù)離子模式下的總離子流圖(如圖1)。進(jìn)樣前用標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)Orbitrap質(zhì)量數(shù)，供試品溶液通過分析器進(jìn)行全掃描，質(zhì)譜觸發(fā)方式為數(shù)據(jù)依賴模式，選擇上一級碎片進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離，利用Orbitrap獲得杜仲顆粒提取液中各色譜峰的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰及MS/MS碎片離子精確相對分子質(zhì)量信息。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、部分對照品質(zhì)譜信息及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，對杜仲顆粒進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，通過高分辨質(zhì)譜信息推導(dǎo)其可能的分子結(jié)構(gòu)。從杜仲顆粒中共定性鑒別出25種化合物，包括8種環(huán)烯醚萜類、8種黃酮類、5種苯丙素類、3種木脂素類化合物及1種非還原性雙糖(見表1)。

表1 杜仲顆粒化學(xué)成分的質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectrum informations of chemical constituents in Duzhong granules

*identified by comparing with reference standards

2.2 環(huán)烯醚萜類化合物的鑒定

通過比較出峰時(shí)間及分析質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合參考文獻(xiàn)及對照品數(shù)據(jù)信息，在負(fù)離子模式下從杜仲顆粒中共鑒定出8種環(huán)烯醚萜類化合物，包括杜仲醇苷、京尼平苷酸、京尼平、車葉草苷酸、去乙酰車葉草苷酸、梓醇、雷撲妥苷和苦參堿B。根據(jù)二級質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)報(bào)道，推測環(huán)烯醚萜類化合物的主要裂解途徑為首先失去母環(huán)上的功能基團(tuán)，如中性丟失H2O、CO2、CH3COOH和糖單元等部分，其次是二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)(葡萄糖)的斷裂[7]。

圖2 車葉草苷酸在負(fù)離子模式下的二級質(zhì)譜圖(A)及可能的裂解途徑(B)Fig.2 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmentation process(B) of asperulosidic acid

圖3 槲皮素-3,4′-二葡糖苷在負(fù)離子模式下的二級質(zhì)譜圖(A)及可能的裂解途徑(B)Fig.3 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmentation process(B) of quercetin-3,4′-O-di-beta-glucopyranoside

化合物4在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M-H]-m/z431.119 69，確定其分子式為C18H24O12，進(jìn)行CID模式產(chǎn)生了m/z251.056 53、269.067 08、225.077 18等碎片離子(圖2)。二級質(zhì)譜中發(fā)生糖苷鍵斷裂，中性丟失葡萄糖殘基(162 u,Glc)或葡萄糖(180 u,Glucose)，推測離子m/z269.067 08(431.119 69-Glc)和m/z251.056 53(431.119 69-Glucose)均由此產(chǎn)生。碎片離子m/z225.077 18是由前體離子m/z269.067 08脫去CO2分子形成。根據(jù)環(huán)烯醚萜類化合物的相對分子質(zhì)量規(guī)律推測化合物4為車葉草苷酸。化合物1的結(jié)構(gòu)與車葉草苷酸類似，僅脫去1分子乙烯酮得到，推測其為去乙酰車葉草苷酸。化合物3的準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z373.113 92脫去葡萄糖殘基得m/z211.061 54，再脫去1個羧基得到m/z167.091 69，經(jīng)與對照品比對確定其為京尼平苷酸。化合物5在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z361.150 60失去葡萄糖殘基(Glu)，形成母核碎片m/z199.097 81，進(jìn)一步失去1個水分子得到m/z181.087 27[M-H-Glu-H2O]-[8]，經(jīng)與對照品比對確認(rèn)其為梓醇。

2.3 黃酮類化合物的鑒定

黃酮類化合物為杜仲顆粒的主要有效成分之一，在負(fù)離子模式下，根據(jù)質(zhì)譜信息共推測出8種黃酮類化合物，包括山柰酚-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷、山柰酚、紫云英苷、莰菲醇-3-O-蕓香糖苷、Peltatoside、異槲皮素、槲皮素-3,4′-二葡糖苷和化合物25。該類化合物在質(zhì)譜高能量碰撞下連續(xù)苷鍵的裂解方式主要為脫去葡萄糖殘基，形成黃酮苷元結(jié)構(gòu)[9]。

化合物11的準(zhǔn)分子離子為[M-H]-m/z447.092 44，確定其分子式為C21H20O11。二級質(zhì)譜中母離子丟失1個葡萄糖殘基(162 u,Glc)，得到碎片離子m/z285.040 89，由黃酮類化合物的裂解規(guī)律推測其為紫云英苷。化合物13的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z595.130 68，確定其分子式為C26H28O16，二級質(zhì)譜中母離子丟失五碳糖殘基(132 u)，得到碎片離子m/z463.089 17，進(jìn)一步丟失葡萄糖殘基(162 u,Glc)，得到碎片離子m/z301.035 71，推測為化合物Peltatoside。化合物15的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z625.140 56，分兩步丟失2個葡萄糖殘基(162 u,Glc)，分別得到碎片離子m/z463.088 20與m/z301.035 55。根據(jù)其裂解方式(如圖3)，提示化合物15為槲皮素-3,4′-二葡糖苷。化合物25的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z757.182 01，確認(rèn)其分子式為C32H38O21，進(jìn)行CID模式產(chǎn)生了m/z595.132 39(757.182 01-Glc)、m/z462.082 15(595.132 39-C5H9O4)、m/z300.027 56(462.082 15- Glc)等碎片離子。

2.4 苯丙素類化合物的鑒定

苯丙素類化合物是形成木脂素的前體，普遍存在于杜仲根皮及綠葉中[10]。本研究從杜仲顆粒中共鑒定了5種苯丙素類化合物，分別為咖啡酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸A。其中，綠原酸為《中國藥典》2015年版中杜仲葉薄層色譜鑒別及含量測定的指標(biāo)成分。

圖4 新綠原酸在負(fù)離子模式下的二級質(zhì)譜圖(A)及可能的裂解途徑(B)Fig.4 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmentation process(B) of neochlorogenic acid

圖5 松脂醇二葡萄糖苷在負(fù)離子模式下的二級質(zhì)譜圖(A)及可能的裂解途徑(B)Fig.5 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmen-tation process(B) of pinoresinol-di-O-β-D-glucopyranoside

化合物17的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z353.087 83，裂解得到咖啡酰殘基碎片離子m/z179.035 46，而后咖啡酰基失去1分子CO2得到碎片離子m/z135.045 65；另一裂解方式則得到碎片[M-H]-m/z191.056 55，而后失去1分子H2O，得到m/z173.046 04，推測該化合物為新綠原酸(如圖4)。綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A與新綠原酸的裂解規(guī)律相似，參考文獻(xiàn)[11]，根據(jù)出峰順序判定綠原酸的各同分異構(gòu)體。化合物20的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z179.034 67，在負(fù)離子模式下裂解產(chǎn)生m/z135.045 49的離子碎片，經(jīng)與對照品比對確定其為咖啡酸。

2.5 木脂素類化合物的鑒定

木脂素為苯丙素氧化聚合而成的天然產(chǎn)物，通常指其二聚物，少數(shù)可見三聚體、四聚體，與糖結(jié)合成苷而存在于植物的木部與樹脂。木脂素的分子結(jié)構(gòu)較為對稱，二級碎片中易脫去葡萄糖殘基，以松脂醇二葡萄糖苷為例說明其裂解途徑。化合物22的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z681.239 87，其二級質(zhì)譜裂解主要失去1個葡萄糖殘基，得到碎片m/z519.190 67，進(jìn)一步裂解得到苷元碎片m/z357.135 13，經(jīng)與對照品比對確定其為松脂醇二葡萄糖苷(如圖5)。另外，杜仲顆粒鑒定出的木脂素類化合物還包括原兒茶酸-4-葡萄糖苷和Olivil-O-β-D-glucopyranoside等。

3 結(jié) 論

本研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS共鑒定出杜仲顆粒的25種化學(xué)成分，包括8種環(huán)烯醚萜類、8種黃酮類、5種苯丙素類、3種木脂素類化合物及1種非還原性雙糖；6種成分經(jīng)與對照品比對而準(zhǔn)確鑒定，其中D-(+)-海藻糖、槲皮素-3,4′-二葡糖苷、Peltatoside和化合物25在杜仲及杜仲葉中為首次報(bào)道。以上成分，黃酮類化合物具有止咳、平喘、抗氧化和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用；松脂醇二葡萄糖苷、咖啡酸和京尼平苷酸為降血壓及抗衰老的重要成分[12-13]，綠原酸具有廣泛抗菌、抗病毒功效[14]，不同種類的藥物活性成分可協(xié)同使杜仲顆粒發(fā)揮補(bǔ)肝腎、降血壓等作用[15]。結(jié)果表明，UPLC-LTQ-Orbitrap-MS可高效、系統(tǒng)地對杜仲顆粒中的化學(xué)成分進(jìn)行快速定性研究，可從整體上闡明杜仲顆粒的化學(xué)組成，為深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制方法提供了依據(jù)。