3株芽孢桿菌在水稻根際定殖促生及其在土壤中的存活

王恒煦，劉澤平，王志剛①，徐偉慧，郭茹鑫 （1.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是生活在土壤或附生于植物根系的有益微生物，PGPR可促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的生長(zhǎng)［1］，由于其環(huán)境友好的特性而被譽(yù)為化肥最有效的替代品。水稻是我國(guó)單產(chǎn)最高、種植面積最大、總產(chǎn)最多的糧食作物［2］，在我國(guó)糧食生產(chǎn)中占有非常重要的地位，與國(guó)計(jì)民生密切相關(guān)［3］，微生物肥料的研究與開(kāi)發(fā)對(duì)水稻種植業(yè)有重要意義。

PGPR在植物根際的定殖能力是評(píng)估其促生效果的關(guān)鍵。土壤細(xì)菌定殖是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)菌性狀與植物反應(yīng)的相互作用［4］。植物和土壤細(xì)菌共同建立特異性的分子信號(hào)聯(lián)系，這種聯(lián)系因植物而異［5］。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與抗性標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合能夠更好地跟蹤PGPR在植物根際的變化及所在生境的微生物群落演替規(guī)律，對(duì)預(yù)測(cè)PGPR與植物的交互作用有重要意義［6］。抗生素標(biāo)記是最早的標(biāo)記方法，通常使用利福平、卡那霉素、四環(huán)素和氨芐青霉素等作為篩選藥物。然而，傳統(tǒng)的抗生素標(biāo)記法難以區(qū)分標(biāo)記菌株與其他抗性菌株，因此，筆者采用多個(gè)藥物梯度對(duì)菌株進(jìn)行篩選和標(biāo)記，以期消除其他抗性菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，得到抗性更強(qiáng)的PGPR。

解鉀功能菌（Bacillus aryabhattai LZP01，簡(jiǎn)稱LZP01）、解磷功能菌（Bacillus pumilus LZP02，簡(jiǎn)稱LZP02）和溶磷功能菌（Bacillus megaterium LZP03，簡(jiǎn)稱LZP03）是3株高效的水稻根際促生菌，這3株菌株對(duì)水稻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要與其分泌植物生長(zhǎng)素和赤霉素有關(guān)［7］。采用抗生素藥物標(biāo)記法研究3株菌株在水稻根際和土壤中的定殖存活能力，并分別在滅菌土與未滅菌土條件下測(cè)定3株菌株對(duì)水稻根系的促生效果，為植物根際促生菌個(gè)體生態(tài)學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)闡釋PGPR根際促生機(jī)制和指導(dǎo)菌肥生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

LZP01、LZP02和LZP03為黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存的菌株［8］，具有促進(jìn)水稻植株與根系生長(zhǎng)的功能。試驗(yàn)用土取自齊齊哈爾嫩江大壩，土壤類型為砂土，晾干后過(guò)篩備用。土壤w（有機(jī)質(zhì)）為20.35 g·kg-1，w（有效磷）為26.52 mg·kg-1，w（速效鉀）為79.00 mg·kg-1，土壤pH值為6.49，可溶性鹽濃度（EC值）為0.76 mS·cm-1。供試水稻品種為龍粳46，抗性藥物為沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司生產(chǎn)的利福平（純度w為98.4%，分子式為C43H58N4O12）。

1.2 培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基（1 L）：瓊脂20 g，酵母5 g，NaCl 8 g，蛋白胨10 g，pH值7.0，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

K-LB培養(yǎng)基（1 L）：瓊脂20 g，酵母5 g，NaCl 8 g，蛋白胨10 g，利福平根據(jù)需要添加，pH值7.0，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，Ca3（PO4）22.0 g，KCl 0.3 g，MnSO4·H2O 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.036 g，瓊脂20.0 g。

蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，卵磷 脂 0.2 g，CaCO31.0 g，酵母 粉 0.5 g，瓊脂20.0 g。

亞歷山大羅夫培養(yǎng)基（1 L）：蔗糖5.0 g，Na2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO30.1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g，鉀長(zhǎng)石粉 1.0 g，瓊脂 20.0 g［8］。

以上所有培養(yǎng)基配成培養(yǎng)液時(shí)不加瓊脂。

1.3 菌株標(biāo)記及生長(zhǎng)特性

1.3.1 菌株抗性標(biāo)記

將LZP01、LZP02和LZP03未標(biāo)記菌株分別在LB培養(yǎng)基上劃線活化后，分別挑取單菌落轉(zhuǎn)入含有5 μg·mL-1利福平的K-LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃和200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h，然后在含有 5 μg·mL-1利福平的K-LB平板上劃線培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后依次經(jīng)含有10、20、50、100、150、180和200 μg·mL-1利福平的K-LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)，直至篩選出穩(wěn)定的抗200 μg·mL-1利福平的突變菌株作為標(biāo)記菌株［9］，分別為K-LZP01、K-LZP02和K-LZP03。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)變化及功能保留

將K-LZP01、K-LZP02和K-LZP03標(biāo)記菌株分別接種于含有200 μg·mL-1利福平的K-LB液體培養(yǎng)基中，LZP01、LZP02和LZP03未標(biāo)記菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，在30℃和200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h后作為6種菌株的種子液。按φ為1%將種子液分別接種于上述兩種培養(yǎng)基中，每2 h對(duì)菌株進(jìn)行吸光值（D600）測(cè)定并繪制生長(zhǎng)曲線。按φ為1%將LZP01和K-LZP01菌液分別于亞歷山大羅夫培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，采用原子吸收分析儀（Z-5000）測(cè)定培養(yǎng)基鉀含量，初始鉀含量記為CK；分別吸取100 μL的LZP02和K-LZP02菌液涂布于蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基中，24 h后采用游標(biāo)卡尺測(cè)定菌株透明圈；分別吸取100 μL的LZP03和K-LZP03菌液涂布于PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，24 h后開(kāi)始測(cè)定透明圈。每個(gè)處理重復(fù)3次［10］。

1.4 水稻幼苗根系對(duì)標(biāo)記菌株的吸附

首先采用清水洗去水稻種子外層灰塵，并在清水中浸泡12 h后將其轉(zhuǎn)移至φ為75%乙醇中處理5 min，再用無(wú)菌水清洗5次，將處理好的水稻種子使用滅菌紗布包裹，置于大平皿中，于33℃條件下在暗處萌發(fā)2 d。挑選已萌發(fā)且健壯的水稻種子，轉(zhuǎn)移至用紗布包裹含有無(wú)菌水的大平皿中，放入28℃條件下人工氣候箱中在每天光照時(shí)間為14 h、黑暗時(shí)間為10 h，濕度為60%條件下培養(yǎng)4 d，得到水稻幼苗。將3株標(biāo)記菌株分別接種于含有200 μg·mL-1利福平的K-LB培養(yǎng)基中，于30℃條件下培養(yǎng)到穩(wěn)定期待用［11］。

1.4.1 時(shí)間與吸附量的關(guān)系

將培養(yǎng)好的水稻幼苗在無(wú)菌條件下從大平皿中取出，將培養(yǎng)的K-LZP01、K-LZP02和K-LZP03這3株標(biāo)記菌株按10 mL（D600=0.5）分裝于9個(gè)平皿中，每個(gè)平皿浸入3棵水稻幼苗，浸入溫度為室溫，分別浸入30 s以及1、2、3、5、10、30、60和120 min后取出幼苗。去掉水稻幼苗莖葉，將水稻幼苗根部菌液使用無(wú)菌濾紙吸干并稱重后，置于加入5 mL無(wú)菌水的滅菌研缽中研碎，混勻后取懸液稀釋濃度分別為1×10-6、1×10-7和1×10-8并進(jìn)行平板涂布，重復(fù)3次，以測(cè)定菌株吸附速率。

1.4.2 菌液濃度與吸附量的關(guān)系

先將3株標(biāo)記菌株使用無(wú)菌水分別稀釋為5×10、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106、5×107和 5×108CFU·mL-1，把洗凈的水稻幼苗分別浸入含有不同標(biāo)記菌株濃度的平皿中，在室溫條件下吸附30 min［11］后取出。去掉水稻幼苗莖葉，將水稻幼苗根部菌液使用無(wú)菌濾紙吸干并稱重后，置于加入5 mL無(wú)菌水的滅菌研缽中研碎，混勻后取稀釋濃度分別為1×10-4、1×10-5和1×10-6的懸液并進(jìn)行平板涂布，每個(gè)處理重復(fù)3次，以測(cè)定菌株吸附速率。

1.5 標(biāo)記菌株的土壤存活率檢測(cè)

分別取3組滅菌土壤（121℃條件下滅菌2 h）和未滅菌土壤各400 g，分別加入40 mL 3株標(biāo)記菌株懸液并充分?jǐn)嚢韬螅謩e裝于水稻育苗盤中，依次標(biāo) 記 為 SK-LZP01、SK-LZP02、SK-LZP03、NKLZP01、NK-LZP02和NK-LZP03，并保持含水量w約為30%，每5 d對(duì)土壤中標(biāo)記菌株濃度進(jìn)行檢測(cè)，共測(cè)5次，每個(gè)處理重復(fù)3次［12］。

1.6 標(biāo)記菌株的促生及定殖檢測(cè)

1.6.1 標(biāo)記菌株對(duì)水稻根系促生能力測(cè)定

使用K-LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)3株標(biāo)記菌株至濃度為D600=0.5。將水稻種子分別播種于添加了30 mL菌液的滅菌土壤（SK-01、SK-02和SK-03）和未滅菌土壤（NK-01、NK-02和NK-03）中，每個(gè)處理播種5粒種子，并設(shè)置未加菌液的滅菌對(duì)照（S-CK）和未滅菌對(duì)照（N-CK），共8個(gè)處理。置于智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)20 d（光照30℃/12 h，黑暗18℃/12 h，濕度為60%），每個(gè)處理隨機(jī)挑取3株水稻幼苗，沖洗泥土并保持根部完整，采用根系分析儀（Scan Maker i800 plus）掃描獲得根系圖像后，采用根系分析軟件（Scan Wizard EZ）分析根系長(zhǎng)度、根直徑、根體積和根表面積。

1.6.2 標(biāo)記菌株在水稻根際定殖檢測(cè)

于20 d后收集水稻幼苗根際（0～0.2 cm）、近根（1～2 cm）、遠(yuǎn)根（5～6 cm）土壤各1 g，加入到10 mL無(wú)菌水中，按120 r·min-1振蕩30 min后分別按1×10-4、1×10-5和1×10-6梯度稀釋，將稀釋液涂布于含有200 μg·mL-1利福平的K-LB平板中，30℃條件下培養(yǎng)2 d后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算單位為CFU·g-1［13］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，采用SigmaPlot 12.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)特性與功能保留

由圖 1可知，K-LZP01和 LZP01、K-LZP02和LZP02、K-LZP03和LZP03在菌株生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)出相似態(tài)勢(shì)，雖然標(biāo)記菌株比未標(biāo)記菌株生物量偏低，但差異不顯著，在18 h后有趨于一致的趨勢(shì)。

對(duì)標(biāo)記菌株進(jìn)行原始功能保留測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌液培養(yǎng)3 d后用原子吸收儀測(cè)量K-LZP01和LZP01培養(yǎng)基ρ（鉀）分別為2.07和2.13 mg·L-1，差異不顯著。而CK處理ρ（鉀）為1.73 mg·L-1，這說(shuō)明菌株生長(zhǎng)期間培養(yǎng)基鉀濃度升高，K-LZP01保持了LZP01的解鉀功能。LZP02、LZP03、K-LZP02和K-LZP03透明圈測(cè)定結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h后，4個(gè)處理均具有透明圈，比值分別為 1.39（K-LZP02）、1.23（K-LZP03）、1.55（LZP02）和 1.55（LZP03），均大于 1，這說(shuō)明 KLZP02具有解磷功能，K-LZP03具有溶磷功能。

圖1 3株芽孢桿菌標(biāo)記和未標(biāo)記菌株生長(zhǎng)特性Fig.1 Growth characteristics of three Bacillus strains

圖2 3株芽孢桿菌標(biāo)記菌株功能測(cè)定Fig.2 Functional determination of three Bacillus resistant strains

2.2 水稻幼苗對(duì)標(biāo)記菌株吸附特性

水稻幼苗根系對(duì)3株標(biāo)記菌株的吸附見(jiàn)圖3。由圖3可知，水稻幼根浸入菌液后，吸附量隨浸入時(shí)間的增加而增大，在10 min后對(duì)K-LZP01的吸附基本穩(wěn)定；在50 min時(shí)對(duì)K-LZP02的吸附達(dá)到最大，隨后有小幅下降趨勢(shì)；在5 min時(shí)對(duì)K-LZP03的吸附達(dá)到最大，最大吸附量為12×107CFU·g-1，隨后趨于動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。將水稻幼苗浸入不同濃度菌懸液中，吸附量隨菌株濃度的增大而增大，K-LZP01和KLZP02濃度達(dá)到5×107CFU·mL-1時(shí)，水稻根系吸附量基本達(dá)到飽和；K-LZP03濃度達(dá)到5×108CFU·mL-1時(shí)，水稻根系吸附量依舊有增加趨勢(shì)。水稻幼苗對(duì)菌株吸附量隨時(shí)間的變化先增加，后趨于穩(wěn)定；隨菌株濃度的增加先趨于穩(wěn)定，后逐漸增大。

圖3 時(shí)間與濃度對(duì)水稻根系吸附3株標(biāo)記菌株的影響Fig.3 Effects of time and concentration on the adsorption of the three Bacillus resistance strains of rice roots

2.3 標(biāo)記菌株在土壤存活量檢測(cè)

由圖4可知，加入K-LZP01和K-LZP02后，滅菌和未滅菌土壤菌株生物量均開(kāi)始下降，0～10 d時(shí)下降速率最為顯著，10～20 d時(shí)下降速率趨緩；加入KLZP03后5 d內(nèi)，土壤菌株量略有上升，隨即開(kāi)始下降，5～10 d時(shí)下降速率最為顯著，10～20 d時(shí)下降速率趨緩。在20 d的監(jiān)測(cè)期內(nèi)，加入K-LZP01和KLZP03的滅菌土壤中菌株生物量均高于未滅菌土壤，說(shuō)明這兩種菌株在滅菌土壤中定殖能力較強(qiáng)；加入K-LZP02的未滅菌土壤中菌株生物量高于滅菌土壤，說(shuō)明K-LZP02在未滅菌土壤中定殖能力較強(qiáng)。

2.4 標(biāo)記菌株對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

3株標(biāo)記菌株對(duì)水稻幼苗根系的影響見(jiàn)圖5。

圖4 時(shí)間對(duì)3株標(biāo)記菌株土壤存活量的影響Fig.4 Effect of time on soil viability of three Bacillus resistant strains

圖5 3株標(biāo)記菌株對(duì)水稻幼苗根系的影響Fig.5 Effects of three Bacillus resistant strains on root system of rice seedlings

由圖5可知，在滅菌土壤中，相較于S-CK處理，SK-03處理水稻幼苗根表面積顯著增加；在未滅菌土壤中，相較于N-CK處理，NK-01和NK-02處理水稻幼苗根表面積均顯著增加（P＜0.05）。在滅菌土壤中，SK-LZP02處理促進(jìn)效果最好，根平均直徑達(dá)0.35 mm；在未滅菌土壤中，NK-02處理促進(jìn)效果最好，根表面積達(dá)0.29 mm。在滅菌土壤中，SK-03處理促進(jìn)效果最好，根體積達(dá)到0.032 cm3；在未滅菌土壤中，相較于N-CK處理，NK-01、NK-02和NK-03處理水稻幼苗根體積均顯著增加（P＜0.05）。在滅菌土壤中，相較于S-CK處理，SK-01和SK-03處理水稻幼苗總根長(zhǎng)均顯著增加（P＜0.05）；在未滅菌土壤中，NK-01處理促進(jìn)效果最好，總根長(zhǎng)達(dá)到4.87 cm。在對(duì)水稻根表面積影響方面，K-LZP03滅菌土處理大于未滅菌土處理，K-LZP01和K-LZP02未滅菌土處理大于滅菌土處理；在對(duì)水稻根平均直徑影響方面，3株標(biāo)記菌株均是滅菌土處理大于未滅菌土處理；在對(duì)水稻根體積影響方面，K-LZP03滅菌土處理大于未滅菌土處理，K-LZP01和K-LZP02未滅菌土處理大于滅菌土處理；在對(duì)水稻總根長(zhǎng)影響方面，3株標(biāo)記菌株均是未滅菌土處理大于滅菌土處理。

2.5 標(biāo)記菌株在水稻根際中的定殖能力

由圖6可知，在滅菌和未滅菌土壤中，3株抗性標(biāo)記菌株定殖量由多到少均依次為根際、近根和遠(yuǎn)根。在水稻根際區(qū)域，滅菌土中K-LZP02處理定殖量顯著最大，定殖量為3×106CFU·g-1；在水稻近根區(qū)域，滅菌土中K-LZP02處理定殖量也顯著最大，為1×106CFU·g-1；在水稻遠(yuǎn)根區(qū)域，未滅菌土中K-LZP03處理定殖量顯著最大，為0.16×106CFU·g-1（P＜0.05）。

3 討論

PGPR具有溶磷、解磷、解鉀和分泌植物激素等生理活性，可以進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，因此常被用來(lái)研發(fā)微生物肥料［14-15］。隨著PGPR研究的興起，越來(lái)越多的優(yōu)良菌株被應(yīng)用到大田中［16］。PGPR在植物根部的定殖能力是影響其促生能力的關(guān)鍵因素［17-18］。研究PGPR在植株體內(nèi)外的定殖方法最常用的是單一抗生素標(biāo)記法［19］。王海霞等［20］采用單一抗生素標(biāo)記法對(duì)高產(chǎn)菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，最終獲得4株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌，多殺菌素平均發(fā)酵產(chǎn)量較出發(fā)菌株ASAGF W2顯著提高。利用單一抗生素抗性篩選技術(shù)選育菌株，簡(jiǎn)單易行且效果顯著。筆者通過(guò)梯度法篩選出對(duì)利福平抗性較高的菌株，為后期菌株定殖與存活研究提供基礎(chǔ)。車建美等［21］標(biāo)記的清枯雷爾氏菌與野生株相比出現(xiàn)生長(zhǎng)滯后現(xiàn)象，而筆者研究中與未標(biāo)記菌株相比標(biāo)記菌株生長(zhǎng)初期生物量略有下降，但生長(zhǎng)后期有趨于一致的趨勢(shì)，并且標(biāo)記菌株保留了原始菌株的生物學(xué)功能，完全可以應(yīng)用于后續(xù)研究。

圖6 3株標(biāo)記菌株在不同根系范圍的定殖情況Fig.6 Colonization of three Bacillus resistant strains in different root regions

PGPR吸附于水稻根表是其定殖的必要條件，也是其起到促生作用的關(guān)鍵［22］。劉慶豐等［23］發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌XF-1能定殖在大白菜根部，在大白菜根際處定殖量變化規(guī)律為先降低后上升再降低，最后基本保持穩(wěn)定；而在根內(nèi)部定殖量變化規(guī)律為先上升后降低。CHEN等［24］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌JM-1128在棉花植株上7 d內(nèi)定殖量顯著下降，但7～21 d內(nèi)定殖量下降緩慢。筆者研究發(fā)現(xiàn)水稻幼根浸入菌液后，吸附量隨浸入時(shí)間的增加而增大，之后趨于動(dòng)態(tài)穩(wěn)定；將水稻幼苗浸入不同濃度菌懸液中，幼根吸附量隨菌株濃度的增大而增大。與其他研究［25］相比，筆者標(biāo)記菌株時(shí)菌株因?yàn)橹苯优c水稻根系接觸，定殖速度更快，定殖能力更加穩(wěn)定，該方法較傳統(tǒng)方法更加簡(jiǎn)便且效果更加顯著，為研究PGPR引入土壤的生態(tài)行為提供了有效的檢測(cè)手段。

在20 d監(jiān)測(cè)期內(nèi)，K-LZP01和K-LZP03滅菌土壤處理中生物量高于未滅菌土壤，這表明這兩種菌株在滅菌土壤中定殖能力較強(qiáng)，而K-LZP02未滅菌土壤處理中生物量高于滅菌土壤，說(shuō)明K-LZP02菌株在未滅菌土壤中定殖能力較強(qiáng)。K-LZP02與KLZP01和K-LZP03生長(zhǎng)差異可能與菌株種類和功能有關(guān)。THEODULOZ 等［26］發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis在溫室條件下在番茄葉片上至少可存活45 d，其菌量?jī)H下降2.5個(gè)單位。余國(guó)運(yùn)等［27］研究發(fā)現(xiàn)小麥增產(chǎn)菌a-47菌株可在營(yíng)養(yǎng)條件好、溫濕度適宜、比較隱蔽、微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的一些有利位點(diǎn)上定殖。筆者研究中，3株標(biāo)記菌株總體趨勢(shì)是生物量隨時(shí)間增加而減少，最后趨于穩(wěn)定。在滅菌和未滅菌土壤中，標(biāo)記菌株均對(duì)水稻根系有促生效應(yīng)，說(shuō)明菌株在土壤中具有明顯競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，能夠顯著優(yōu)化根系結(jié)構(gòu)，促進(jìn)根系總根長(zhǎng)、根表面積和根體積增加，這與呂雅悠等［28］研究結(jié)果一致。在滅菌土壤中，3株抗性標(biāo)記菌株在土壤中定殖量由大到小均依次為根際、近根和遠(yuǎn)根，此與王珍等［29］研究結(jié)果一致。距離水稻根際越近，土壤中標(biāo)記菌株含量就越高，這說(shuō)明菌株具有良好的定殖能力和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)［30］，且與水稻根系間可能存在互利共生關(guān)系。

4 結(jié)論

采用抗性藥物利福平梯度篩選方法對(duì)3株具有促生功能的PGPR菌株進(jìn)行抗性標(biāo)記，得到能穩(wěn)定生長(zhǎng)且保留原始功能的K-LZP01、K-LZP02和KLZP03標(biāo)記菌株。標(biāo)記菌株可在土壤及水稻根際很好地定殖，并對(duì)水稻根系具有很好的促進(jìn)作用，并且標(biāo)記菌株主要定殖于水稻根際處。該試驗(yàn)為闡釋水稻根際促生菌的促生機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)微生物菌劑的商業(yè)化發(fā)展具有較大意義。