新疆沙爾套山天然草地主要混合牧草營養指標近紅外光譜分析

張凡凡， 尉小霞， 段宏偉， 于 磊*， 張文舉

(1. 石河子大學動物科技學院， 新疆 石河子 832000； 2. 中國農業大學工學院， 北京 100083)

天然草地的牧草是當地畜牧業生產的重要來源[1]。在畜牧業生產中，準確、快速、實時獲取天然草地牧草營養信息，可為有效評估天然草地營養供給和營養載畜量奠定基礎[2]。目前，近紅外光譜技術(Near infrared reflectance spectroscopy,NIRS)已成為國內外牧草成分鑒定和品質分析的一種可靠方法[3]。豆科牧草方面的研究表明，紫花苜蓿(Medicagosativa)、紅花車軸草(Trifoliumpratense)、白花車軸草(Trifoliumrepens)和百脈根(Lotuscorniculatus)4種混合豆科牧草建立的粗蛋白(Crude protein,CP)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)營養成分的NIRS模型決定系數(Rc2)均≥0.93[4]。劉哲等[5]除了利用NIRS技術準確測定苜蓿的CP、鈣(Ca)的含量外，還預測了粗灰分(Ash)的含量。此外，很多國內外學者利用NIRS技術對豆科牧草的營養品質均進行了預測，其營養品質指標的相關系數(Rp2)均可達到0.92以上[6-8]。對于其他種類牧草的研究表明，利用NIRS技術建立老芒麥(Elymussibiricus)CP，ADF，NDF的預測模型，其模型驗證Rc2≥0.80，Rp2≥0.94[9]。Ruano等[10]建立了半干旱草地草本植物、禾本科、豆科、雜類草混合的Ca、P等微量元素NIRS模型。我國學者也利用NIRS建立了天然草地牧草CP、NDF、粗脂肪(Ether extract,EE)的定量分析模型[11]。縱觀以往研究發現，NIRS技術可以很好地進行牧草營養品質的快速檢測，并且針對各項營養價值指標均可建立可信的預測模型。所以目前在在天然草地營養品質評價方面，利用NIRS技術建立快速的營養價值評價模型可滿足不同地區的實際生產，而目前研究尚未建立不同地區、不同草地類型天然牧草營養成分定量分析模型。

由于新疆牧區是我國當前放牧經營發展的重要區域，因此牧草營養價值的快速評價變得尤為重要，對天然草地營養價值的快速定量分析，不僅有益于天然草地放牧經營的成效性，且直接影響放牧家畜營養攝入的水平。而由于新疆天然草地牧草種類和組成復雜多樣，利用NIRS技術對其營養品質的各項主要指標進行快速檢測是否可行？將各科、屬主要牧草進行混合測定分析，其光譜特征如何？鑒于此，本研究以新疆昭蘇縣境內的沙爾套山為研究區域，對其分布的主要混合牧草進行營養品質(CP，NDF，ADF，Ash，Ca，P)的NIRS分析，以期運用NIRS技術對新疆天然草地牧草營養品質的快速檢測方面有一個新的突破，并為建立適用、準確的新疆天然草地NIRS模型提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區域位于新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣域內的沙爾套山，該山屬天山山脈西段分支，是形成昭蘇盆地的主體山脈之一。其山脈大體呈東西走向，主體山脈西、北兩側與哈薩克斯坦接壤，南側延伸至昭蘇盆地的特克斯河岸，向東延伸到康蘇河溝與昭蘇馬場草地相鄰。山脈東西長41.5 km；南北寬26～28 km，地理坐標為東經80°15′～80°54′，北緯42°54′～43°11′，山脈整體海拔高度為1 650～3 400 m，山嶺脊線海拔高度為3 200～3 400 m。整個昭蘇盆地氣候屬中溫帶山區半濕潤、半干旱冷涼氣候，年均溫2.9℃，具有降水多、積溫少等氣候特征[1,12]。

1.2 樣本采樣方法

于2016年在研究區內各季節牧場選擇植被發育完整地段，設置固定圍欄保護，或在原有的圍欄內再設置小圍欄保護。圍欄內設置1 m×1 m樣方，根據牧草生長季節(6—11月)，以及不同的生境(低山半陽坡/半陰坡、低山丘陵陽坡面、低山緩陰坡/灘地、中山和緩和坡面、中山帶緩陰坡面、山麓帶及低山殘丘、特克斯河岸階地、亞高山大陽/陰坡面、高山帶坡面)進行采樣，收集樣方框內的全部飼草，并剔除有毒植物及牲畜不食植物。共采集到32種主要飼草，其中禾本科牧草14種：芨芨草(Achnatherumsplendens)、冰草(Agropyroncristatum)、巨序剪股穎(Agrostisgigantea)、無芒雀麥(Bromusinermis)、短芒短柄草(Brachypodiumpinnatum)、鴨茅(Dactylisglomerata)、披堿草(Elymusdahuricus)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、麥薲草(Elymustangutorum)、羊茅(Festucaovina)、假梯牧草(Phleumphleoides)、細葉早熟禾(Poaangustifolia)、長芒大穗鵝觀草(Roegneriaaboliniivar.divaricans)、針茅(Stipacapillata)。豆科牧草12種：草原山黧豆(Lathyruspratensis)、塊莖山黧豆(Lathyrustuberosus)、西伯利亞山黧豆(Lathyruspisiformis)、黃花苜蓿(Medicagofalcata)、羅馬苜蓿(Medicagofalacatavar.romanica)、西伯利亞驢食豆(Onobrychistanaitica)、米爾克棘豆(Oxytropismerkensis)、野火球(Trifoliumlupinaster)、白花車軸草(Trifoliumrepens)、紅花車軸草(Trifoliumpratens)、線葉野豌豆(Viciatenuifolia)、廣布野豌豆(Viciacracca)。鳶尾科1種：紫花鳶尾(Irisruthenica)。莎草科2種：細果苔草(Carexstenocarpa)、線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)。牻牛兒苗科1種：草原老鸛草(Geraniumpratense)。薔薇科2種：西伯利亞羽衣草(Alchemillasibirica)、高山地榆(Sanguisorbaalpina)。其中除西伯利亞羽衣草、細果苔草、線葉嵩草、高山地榆所處于高海拔的地帶，僅在7—8月測定采樣外，其他種類牧草每月均分別采樣[13]，每種牧草采集2份(即至少從2個楊方框中采集到)，共計118份。采集完將上述飼草按照其在樣方框內的自然分布頻度混合，以反映該天然草地牧草實際生長情況。將采集的混合樣品稱重后帶回實驗室放入烘箱65℃烘48 h，粉碎過40目篩(孔徑為0.425 mm)后裝入自封袋用于近紅外光譜掃描和營養物質測定。

1.3 主要儀器和試驗方法

1.3.1 主要儀器與分析軟件 試驗使用近紅外光譜分析儀(DS2500，FOSS公司)進行光譜掃描。工作參數：波長范圍，400～2 500 nm；雙檢測器系統，硅檢測器(400～1 100 nm)，硫化鉛檢測器(1 100～2 500 nm)；數據采集頻率，掃描2/s；波長準確度<0.05 nm；光譜分辨率：0.5 nm；定標軟件為Win ISI Ⅲ；數據采集形式為lg(1/R)。工作條件：穩定25℃室溫[11]。

1.3.2 營養物質測定方法 采用國標法進行營養物質測定[14]。其中粗蛋白質(CP)采用凱氏定氮法測定，粗灰分(Ash)采用灰化法測定，酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)采用Van Soest分析法測定，鈣(Ca)采用EDTA絡合滴定法測定，磷(P)采用鉬銻抗比色法測定。

1.3.3 樣本近紅外光譜掃描 將處理好的樣品裝入樣品杯，大約為杯容量的3/4，每個樣品重復掃描6次，每次均掃描背景，取平均光譜為樣品光譜圖，消除由裝樣密度及樣品粒度不均勻造成的誤差。

1.3.4 近紅外光譜模型的建立與驗證 將樣品均按3∶1隨機分為定標集和驗證集。驗證集樣品化學值均在定標集樣品化學值的范圍內。利用定標分析軟件(Win ISI Ⅲ)，采用修正偏最小二乘法(MPLS)，結合散射處理、導數、平滑等不同的光譜預處理和數學處理方法，用定標集樣品建立模型。建模時用馬氏距離對光譜異常值進行檢驗；絕對偏差對測定值(實驗室實測值)進行檢驗，以提高模型的準確度。同時，采用交叉驗證防止過擬合現象。模型的評價根據定標標準偏差(Standard error of calibration,SEC)、交叉檢驗標準誤差(Standard error of cross validation,SECV)、交叉驗證決定系數(1-VR)、預測標準誤差(Standard error of prediction,SEP)等確定最優模型。驗證集樣品對最優模型進行外部驗證，評價其外部預測能力。最后，用交叉驗證相對分析誤差(Relative prediction deviation for cross validation,RPDCV)(RPDCV=標準偏差/SECV)和外部驗證相對分析誤差(Relative prediction deviation of prediction,RPDP)(RPDP=SD/SEP)對模型進一步評價，其中RPDCV和RPDP均>3，說明建立的模型可以用于精準的定量分析；RPDP<2.5，說明難于進行NIRS定量分析；2.5≤RPDP<3，模型的預測精度有待進一步提高[11]。

2 結果與分析

2.1 牧草營養物質含量測定

試驗采集32種不同生育期和生境環境的天然牧草來，這使得牧草樣本各營養物質含量(化學成分含量)產生較大不同，其中CP,Ash,Ca和P含量最大值分別為19.18%，13.9%，3.35%和0.34%，NDF和ADF最小值分別為32.50%和20.21%，這些極端值主要出現在6月采集的樣本中；CP,Ash,Ca和P含量最小值分別3.87%，4.00%，0.33%和0.09%，NDF和ADF含量最大值分別為69.82%和43.21%，這些極端值主要出現在10—11月采集的牧草樣本中。定標集變異系數按大小排序為：Ca>CP=P>NDF>ADF>Ash。驗證集變異系數按大小排序為：Ca>P>CP>ADF>NDF=Ash(表1)。

表1 牧草樣品營養物質含量分析Table 1 Nutrient content analysis results of calibration and validation samples

2.2 牧草樣品光譜測定結果

本研究全年牧草樣品光譜圖如圖1。由于牧草樣本的種類和數量均不同，因此總體光譜響應曲線有一定的變化范圍，呈現光譜帶，牧草樣品光譜在全波長范圍內(400～2500 nm)存在多個吸收峰，為其營養成分的定量分析提供了豐富的信息，其中最大吸收峰出現在以450 nm為中心的藍波段(圖1，A點)和670 nm為中心的紅波段(圖1，B點)。

圖1 全年牧草樣品光譜圖Fig.1 The spectra of grass

2.3 牧草樣本各營養成分預測模型的建立與優化

運用Win ISI Ⅲ定標軟件中MPLS法，通過不同光譜預處理和數學處理，對定標集樣品建模，選出最佳定標模型。建立的CP，NDF和ADF定標模型1-VR系數較大。此外，本研究對CP，NDF和ADF的校正模型進行了內部交叉檢驗，并剔出了異常樣品，得到了CP，NDF，ADF的最佳校正模型。經過4種不同處理選擇的最優模型所得出的數據，其SEC，SECV，1-VR，RPDCV的結果如表2所示。由表2可以看出，CP，NDF，ADF，Ash，Ca和P的SECV分別為2.36，6.17，3.87，0.85，0.24和0.07，1-VR分別為0.82，0.80，0.78，0.50，0.72和0.65，其中1-VR較高的為CP，NDF和ADF(均>0.75)，但只有CP的RPDCV>2.5；NDF，ADF，Ash，Ca和P的RPDCV均<2.5。根據建議的模型評價標準，建立的CP可進行NIRS定量分析，其余指標的定量分析模型還需要進一步完善和優化[15]。

表2 定標樣本各營養指標光譜模型參數Table 2 The parameters of the spectrum model of the calibration samples on each nutrition index

注：NT為無散射處理。SNV+De為標準正常化+去散射處理。1,4,4,1為一階導數處理，數據間隔點為4，平滑處理間隔點為4，二次平滑處理間隔點為1；2,4,4,1為二階導數處理處理，數據間隔點為4，平滑處理間隔點為4，二次平滑處理間隔點為1

Note:NT:Non-scattering treatment. SNV+De:Standard normalization treatment + detrend. 1,4,4,1:first derivative,the data interval and smooth processing interval is four,the second smooth treatment interval is one. 2,4,4,1:second derivative,the data interval and smooth processing interval is four,the second smooth treatment interval is one

2.4 近紅外光譜模型預測效果評價

校正模型建立后，為了進一步驗證所建模型的預測效果，選用SEP、RPDP等參數，用驗證集樣品對預測模型進行外部驗證，以評價模型的實際預測效果。結果表明，各營養指標實測值和預測值間差異均不顯著(P>0.05)，但從外部驗證結果表明，建立的預測模型對于牧草的各項營養指標的預測結果不夠理想，其中預測相關系數R2較高的為0.84(ADF)、NDF(0.73)和0.66(CP)(表3)。圖2為實測值與光譜預測值關系，其中ADF實測值(X)和預測值(Y)間關系為：Y=0.87X+6.25(R2=0.84)，NDF為：Y=0.61X+24.75(R2=0.73)，CP為Y=0.82X+2.19(R2=0.66)，所以采用NIRS技術可在一定程度上預測天然草地牧草CP、ADF和NDF含量，而對于Ash，Ca和P的相關度較低，不能進行定量分析。此外，通過RPDP值進一步評價，僅CP含量滿足NIRS定量分析要求，但預測精度有待提高，其余指標均不能滿足NIRS定量分析條件。

表3 驗證樣本的預測結果Table 3 The result of prediction of validation sample

注：實際測定值和光譜預測值差異性分析采用Duncan新復極差法進行多重比較，差異顯著性水平為0.05

Note:The difference between the actual measured value and the spectral predicted value was analyzed by Duncan method,and the difference significance level was 0.05

圖2 實際測定值與光譜預測值關系分析Fig.2 Relationship between the actual measured value and the NIRS predictive value

3 討論

沙爾套山天然草地主要組成牧草為禾本科(14種)和豆科(12種)牧草。以往利用NIRS技術在單一禾本科牧草(黑麥草Loliumperenne、燕麥Avenasativa、羊草Leymuschinensis)營養價值快速評價的研究結果表明，不同地域、品種和成熟期黑麥草CP含量預測值和測定值間的相關系數可達到0.99[16]；燕麥全株干草可建立穩定的CP、NDF和ADF含量的矯正模型，且CP和NDF的決定系數在0.95以上[17]；羊草(干草)CP、NDF和ADF含量的矯正模型，其相關系數均可達到0.95以上[18]。對于單一豆科牧草，眾多學者建立了苜蓿鮮草、干草、草顆粒營養物質(CP，NDF，ADF)的NIRS模型，其相關系數均可達到0.92以上[5,7,8]。由此表明，NIRS技術可以建立單一牧草的營養價值快速檢測模型。而由于天然草地牧草組成成分較為復雜，利用NIRS技術是否能建立穩定的營養價值預測模型，學者們也進行了相關研究，采用禾本科、豆科混合牧草樣品建立的CP定標模型，可以很好預測牧草的CP值[19]；采用紫花苜蓿、百脈根、紅花車軸草、鴨茅和梯牧草(Phleumpratense)建立的CP，NDF，ADF定標模型，也可以很好地預測混合牧草營養物質含量[4]。

本研究中，對于CP、NDF和ADF含量建立的NIRS模型，其均可在一定程度上進行預測，但預測精度還有待提高。其主要原因為采集混合牧草種類較多(32種)，樣品采集地點較廣泛，海拔也不同，包括山地的不同坡面，這使得樣品中化學成分形成較大的含量梯度，從而使模型具有較廣的預測范圍，但精度還需要繼續優化。另外，采集的牧草處于不同的生育期，營養指標含量變幅較大，CP為2.25%～27.60%，NDF為30.50%～90.50%，ADF為17.50%～68.30%，各營養成分的含量變幅基本上可以涵蓋不同種類牧草樣品可能會出現的含量水平。因此，從這個角度看，試驗樣品具有很好的代表性，但同時樣品間存在很大差異，對預測結果也有一定影響。有學者[20]也證實建立天然草地牧草NIRS模型時，建模樣品的年份、品種、產地以及組分模型的化學值分布等情況會影響建模樣品的代表性和所建模型的性能。此外，本研究建模樣本和驗證集樣本數量較少，且在建模優化過程中剔除了一定數量的樣本(表2)，這也使得建模的精確度和準確度降低，從而使得建立的模型不夠理想，因此在今后研究中還需要加大天然草地樣本量的選取，進一步提高模型準確性。

以往研究利用NIRS技術對Ash，Ca和P等無機物的快速檢測結果表明，利用NIRS技術可以很好地預測不同木本植物葉片中Ash，Ca和P的含量，其中Ca和P的相關系數分別為0.95和0.94，其主要原因是由于無機物和蛋白質等有機物結合，這使得結合物質中的各種基團在一定的波長下產生了吸收峰，所以礦物質元素與蛋白質等有機物之間的鍵為NIRS的檢測提供了一定基礎[21]。此外，應用NIRS技術也可以滿足半干旱草地草本植物、禾本科、豆科、雜類草Ca、P元素分析[22]。而也有研究認為NIRS檢測礦物質的能力有限[23]。本研究利用NIRS技術建立的混合牧草樣本Ash、Ca和P的模型精確度和準確度均不能達到建模要求，其一方面可能由于礦質元素在植物體內的含量低，達不到NIRS的檢測范圍；另一方面有機分子與礦物質的結合體會隨著季節而變化，其因牧草種類不同，使測定結果不穩定；另外礦質元素在植物體中也多以離子態存在，NIRS無法對其進行有效檢測。所以應用NIRS分析牧草中礦物質元素含量還有待進一步研究和改進。雖然建模效果不理想，但使用多科屬混合牧草建立的預測模型，在研究中少見，其作為新疆天然草地牧草研究的一個突破點，還需要對定標集進行進一步擴充和完善，以提高預測準確度。此外，試驗中對牧草微量元素測定還沒有涉及，在今后的工作中需要通過測定多種指標和擴充樣本量以及降低實際測定誤差等多種方法對定標方程進行逐步的校正，從而實現牧草利用價值的準確應用，最終建立各地區天然牧草營養價值數據庫并實現共享，為草原牧草營養價值監測和草食家畜精準飼喂管理提供便利。

4 結論

利用近紅外光譜檢測技術可以建立沙爾套山天然草地32種主要混合牧草粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的檢測模型，其交叉驗證決定系數分別為0.82，0.80和0.78；外部驗證相對分析誤差分別為2.67，2.20和2.28，相關性分別為0.66，0.73和0.84其模型精確度和驗證準確度還有待提高。利用近紅外光譜檢測技術不能建立粗灰分、鈣和磷的檢測模型。