AMF與坪床基質對“蘭引3號”結縷草草坪磷元素有效性及其流失的影響

彭 雪， 程俊康， 辛國榮

(廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室， 中山大學生命科學學院, 廣東 廣州 510275)

2016年5月國家發改委在《全國足球場地設施建設規劃(2016-2020年)》[1]中明確提出了建設目標：到2020年，全國足球場地數量超過7萬塊，按照標準足球場長105 m、寬68 m來計算，到2020年，國內足球場面積將達到5 000萬m2，這將給足球場草坪的發展帶來無限的機遇和技術上的挑戰。標準的足球運動場草坪坪床基質結構特殊，且以砂基坪床為主，砂基坪床因其良好的透水透氣性被用于建造運動場坪床，但是砂基坪床的保水保肥性較純土坪床相對較差，坪床中養分容易流失，特別是南方地區高溫多雨，引起養分流失和地下水污染的風險更高。因此，如何做到球場草坪質量優良，節約資源，進而防止環境污染，是草坪科技和管理者需要解決的問題。

草坪草種的選擇是建植高級草坪的首要因素，根據區域和地理環境的不同，選擇適合條件的草坪草種，以滿足足球場草坪的坪用性狀要求?！疤m引3號”結縷草(Zoysiajaponica‘Lanyin No. 3’)作為典型的暖季型草坪草，具有建坪速度快，耐踐踏，葉質良好，不易擦傷皮膚等優點，被廣泛用于我國南方運動場建植中，如廣州天河體育場、廣東奧林匹克體育中心、廣州大學城中心體育場等。

近年來從基質改良著手，利用一些有益微生物的共生特點，輔助完成高級運動場草坪管理的微生物技術引起人們的關注。叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)就是其中的一類，它能與陸地80%以上的被子植物形成共生結構。AMF與植物根共生后，其根外菌絲形成龐大的“菌絲網絡”，擴大植物根部養分吸收范圍，植物通過菌絲將根系吸收不到的養分吸收利用，AMF不僅能活化土壤中的礦質養分，促進植物對營養元素如氮、磷[2-3]等礦質元素的吸收和利用效率，而且植物根際與AMF菌絲之間的“元素貿易”與土壤中N、P元素的比率密切相關；同時，外延菌絲還可通過侵入點再度侵染鄰株植物根系后，在多株相同或不同植物之間形成龐大的地下公共菌絲網(Common mycorrhizal networks,CMN)，CMN的形成能夠加強鄰株植物之間營養元素的傳遞，對植物個體間營養平衡和物種多樣性維持等方面具有重要的生態功能。鑒于菌根在植物營養吸收中的獨特作用，本研究選擇被廣泛用于南方足球運動場草坪建植的“蘭引3號”結縷草，通過設計基質配比和菌根真菌接種試驗，對比分析AM對養分(磷元素)的吸收、吸附、流失的影響，進一步探討AMF侵染在足球場草坪水肥管理建植中的作用效應及應用前景。

1 材料與方法

1.1 坪床基質準備

通過模擬足球運動場草坪坪床根際混合層(約10 cm)進行試驗。選用營養土與河砂作為坪床基質，營養土(滿園春營養土)主要成分包括活性炭、珍珠巖、蛭石、腐熟植物秸稈、酒渣、雞糞；河砂為建筑用砂。有研究表明，當含砂量為50% ～ 75%(體積比)時，保水保肥性最好，且具有較好的土壤通氣狀況[4]。因此，本試驗設置土砂體積比例分別為2∶8(含砂量為80%)、4∶6(含砂量為60%)、6∶4(含砂量為40%)。營養土以及洗凈的河砂于高溫高壓滅菌鍋中滅菌120℃，2次，每次30 min。放置至室溫后，按照上述體積比將河砂與營養土混勻，分別裝于100 mm×85 mm×95 mm(口底高)的塑料花盆中。對種植前基質的重量以及基質中堿解氮、全氮、速效磷、全磷、全鉀含量進行測定(表1)?；ㄅ枋孪冉涍^70%酒精浸泡30 min后，用自來水沖洗數次直至干凈。

表1 設計坪床基質基礎養分狀況Table 1 Nutrient condition of potting media before planting

1.2 菌劑的施用

摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)、根內球囊霉(Rhizophagusintraradices)由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供。菌劑采用濕篩傾析法檢測5 g菌劑的孢子數量，發現摩西管柄囊霉與根內球囊霉的孢子數量分別是97個和23個。摩西管柄囊霉組每盆加入2.5 g菌劑，根內球囊霉組每盆加入10 g菌劑，以保持較為一致的接種勢。在距花盆口2 cm處加入菌劑或不加。

1.3 試驗處理

試驗設不接種對照組(ck)，接種摩西管柄囊霉組(Funneliformismosseae,Gm)、接種根內球囊霉組(Rhizophagusintraradices,Ri)三個處理；基質配比營養土:河砂體積比分別是2∶8，4∶6，6∶4。每個處理重復4次，共36盆。

1.4 植株種植培養與采集

草坪草為“蘭引3號”結縷草(Zoysiajaponicacv. lanyin No. 3)，草種購買于小胖花園園藝網店，草種發芽率為80%。2015年7月17日播種，播種量為每盆1 g，表面覆一層約1 mm的基質，淋水保持濕度，放入恒溫培養箱培養，出芽后于當月31日將盆移入大棚進行管理養護。用自動噴灌系統每天早晚各噴灌1 min。10月28日(已成坪)，每盆加入德國獅馬牌復合肥m(N)∶m(P)∶m(K)=15∶15∶15(廈門四葉草肥料超市)0.4 g。復合肥實際m(N)∶m(P)∶m(K)=6.9∶4.3∶11.7(中科檢測有限公司測定)。施肥后用噴壺連續淋水3 d，每天3次，確?；|濕潤且無滲濾液流出。11月1日進行滲濾液收集。

1.5 滲濾液及樣品收集

在每個花盆下方放置滲濾液接收裝置，分別對不接種對照組(ck)，接種摩西管柄囊霉組(Gm)、接種根內球囊霉組(Ri)的滲濾液進行收集測定。11月1日進行第一次大量澆水，每盆體積相同，澆水后等待30 min，直至盆底有極少或沒有液滴流下，收集滲濾液并用量筒測定體積，取10 mL用濾膜進行過濾，除去滲濾液中的土壤顆粒及雜質，過濾后的滲濾液保存于10 mL離心管中，用于正磷酸根離子測定；于11月5日和11月9日重復11月1日的操作。11月10日分別收集植物地下部與地下部。將植物地上部剪下，洗凈后放于紙袋中于70℃烘箱中烘干用于植物地上部P含量的測定；植物地下部抖落根際多余泥土，洗凈，稱鮮重，部分放于4℃冰箱進行保鮮，用于侵染率等指標的測定，剩余地下部樣品放于紙袋中于70℃烘箱中烘干用于P含量的測定。

1.6 理化指標及微生物指標測定

植物中磷含量采用鉬銻抗比色法[5]?；|有效磷：0.05 mol·L-1HCL-0.025 mol·L-1H2SO4浸提，鉬銻抗比色法[6]。滲濾液中的離子用離子色譜儀(陰離子檢測Thermo Dionex ICS-5000，陽離子檢測Thermo Dionex ICS-900)測定正磷酸根離子含量[7]。

植物根系AMF侵染率(菌絲侵染率、叢枝侵染率、泡囊侵染率、總侵染率)采用臺盼藍(trypanblue)染色鏡檢法[8]，鏡檢計數時采用網格計數法[9]?；|中孢子數量采用濕篩傾析法[10]進行分離后在體視鏡下進行鏡檢計數。

1.7 數據分析

試驗數據均以平均值±標準誤表示；結果用SPSS 2.0軟件進行雙因素方差分析(two-way analysis of variance)，主效應顯著則用LSD法進行事后檢驗分析，交互作用顯著則進行簡單效應分析，對無顯著交互效應的指標用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析相同基質下ck組，Gm組，Ri組之間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 AMF侵染情況

從表2看出，在3種試驗坪床基質下，接種Gm或Ri，“蘭引3號”結縷草根內主要的侵染形式為菌絲侵染，泡囊侵染較少，叢枝侵染罕有或少有(忽略不計)。接種Gm在2∶8，4∶6，6∶4的土砂比基質中菌絲侵染率分別達到了16%，26%，15%，其中4∶6土砂比基質中Gm菌絲侵染率最高；而接種Ri在2∶8，4∶6，6∶4土砂比基質中菌絲侵染率分別達到了18%，11%，14%，其中2∶8土砂比基質中Ri的菌絲侵染率最高。

另外，2∶8土砂比基質中，Gm、Ri與ck之間在菌絲侵染率和總侵染率指標中出現了極顯著差異，而接種Gm與Ri之間的菌絲侵染率與總侵染率均未達顯著差異(表2)；4∶6土砂比基質中，4∶6Gm組的菌絲侵染率與總侵染率顯著高于4∶6ck組與4∶6Ri組，且4∶6Ri也顯著高于4∶6ck(表2)；6∶4土砂比基質中，接種組與6∶4ck之間在菌絲侵染率與總侵染率指標上差異顯著(6∶4ck-6∶4Gm：P菌絲<0.01，P總<0.01；6∶4ck-6∶4Ri：P菌絲<0.01，P總<0.01)，而6∶4Gm與6∶4Ri間差異不顯著(表2)。

對總侵染率進行雙因素方差分析結果表明，土壤基質與菌劑的交互效應對總侵染率沒有顯著影響，且土壤基質主效應對于總侵染率也沒有顯著影響，但菌劑主效應顯著影響總侵染率(P<0.01)。

表2 不同處理AMF侵染率Table 2 AMF colonization rate in different treatments

注：表中結果表示為平均值±標準誤。其中各處理樣品數為3。不同小寫字母表示同一基質下不同接種處理各侵染形式間具有差異顯著性(P<0.05)

Note：The results in the table were expressed as mean± standard error. The number of repeat samples was 3. Different lowercase letters indicated significant difference among colonization rate under the same soil matrix at the 0.05 level

2.2 AMF與基質對結縷草生物量的影響

相同基質下，6∶4Gm組與6∶4Ri組地上部生物量顯著低于6∶4ck組，而在2∶8和4∶6基質中接種組與ck組之間差異不顯著，即接種Gm與Ri在6∶4基質下能夠顯著的減少“蘭引3號”結縷草地上部干重。而對植物地下部鮮重而言，相同基質下，不論接種Gm或Ri，其地下部生物量均與ck組之間無顯著差異(圖1)。

圖1 三種基質下接種菌劑與不接種菌劑對結縷草生物量的影響Fig.1 The effect of potting media and AMF on grass biomass注：圖中結果表示為平均值，誤差線代表標準誤。其中地上部各處理樣品數為4，地下部各處理樣品數為3。不同的小寫字母代表相同基質下不同處理間具有顯著性差異(P<0.05)Note：the results in the figure are expressed as the mean value,and the error line represents the standard error. N=4 for each treated sample of aboveground index,and n=3 for each treated sample of underground index. Different lowercase letters represent significant differences between different treatments under the same soil matrix at the 0.05 level

2.3 AMF與基質對P元素的影響

對基質中有效磷總量、結縷草地上部與地下部磷總量、以及滲濾液中正磷酸鹽總量(表3)進行雙因素方差分析發現，基質與AMF的交互作用顯著，主要體現在基質有效磷總量、結縷草地上部磷總量以及滲濾液中正磷酸鹽總量方面(表4)。2∶8ck的基質速效磷總量顯著低于2∶8Gm(P< 0.05)與2∶8Ri(P< 0.05)，但6∶4Ri組速效磷總量極顯著低于6∶4ck組(P< 0.01)；在4∶6基質中，不接種組(ck組)與接種Gm或Ri組之間在基質速效磷總量上差異未達顯著。從基質中有效磷占試驗體系中輸入總磷量(種植前相同基質配比下的全磷總量+施肥加入的磷元素的量)的比例來看，2∶8Gm(49.77%)與2∶8Ri(51.28%)顯著高于2∶8ck(29.17%)。

植物地上部P總量，6∶4ck組顯著高于6∶4Gm組(P< 0.01)和6∶4Ri組(P< 0.01)，但在2∶8或4∶6基質中，ck組、Gm組、Ri組之間差異未達顯著。分析植物地上部P占試驗體系中輸入總磷量比例，6∶4Gm和6∶4Ri顯著低于6∶4ck組，而在2∶8與4∶6配比中，接種與否不影響地上部P元素的占比。結合雙因素方差分析結果，值得注意的是，4∶6基質地上部磷總量占比顯著高于2∶8基質占比，也就是說，在2∶8與4∶6基質中接種AMF對結縷草地上部P總量沒有顯著影響，基質的不同更能影響植物地上部P元素的總量，且4∶6基質相較于2∶8基質能夠積累更多的地上部P元素。

而地下部的P，在相同的基質中，接種與不接種之間差異不顯著。雙因素方差分析發現，基質與菌劑因素對植物地下部P元素總量影響顯著，但是基質與菌劑之間不存在交互作用。相同的基質下，接種AMF與否對植物地下部P元素影響不大。

單因素方差分析發現，2∶8ck組滲濾液中磷酸根離子總量顯著低于2∶8Gm組(P< 0.01)與2∶8Ri組(P< 0.01)，而同樣的趨勢出現在4∶6基質中，4∶6ck組磷酸根離子顯著低于4∶6Gm組(P< 0.01)和2∶8Ri組(P< 0.05)。雙因素分析可知，菌劑與基質能夠顯著的影響滲濾液中正磷酸根離子總量，且菌劑與基質之間存在著極顯著的交互效應(P< 0.01)。而且通過分析滲濾液中正磷酸根離子總量占體系輸入磷總量比例數據可以得知，三種基質截留P元素的能力分別是：6∶4基質強于4∶6基質強于2∶8基質，而且在2∶8和4∶6基質中，接種AMF能夠顯著的減少P酸根離子的流失。

表3 AMF與基質對坪床基質、植物、滲濾液中P元素總量影響Table 3 Effect of potting media and AMF on P transport in potting media,plant and leachate

注：表格中數值表示平均值±標準誤。地上部指標各處理樣品數n=4，地下部指標各處理樣品數n=3。不同的小寫字母代表相同基質下不同菌劑處理間差異顯著(P<0.05)。占比為占試驗體系輸入的磷元素的總量，即種植前相同基質配比下的全磷總量+施肥加入的磷元素的量?；|有效磷占比(%)=基質有效磷總量/(種植前相同基質配比下的全磷總量+施肥加入的磷元素的量)╳100%;地上部磷占比(%)=地上部磷總量/(種植前相同基質配比下的全磷總量+施肥加入的磷元素的量)╳100%;地下部磷占比(%)=地下部磷總量/(種植前相同基質配比下的全磷總量+施肥加入的磷元素的量)╳100%;滲濾液中磷酸根離子占比(%)=滲濾液中磷酸根離子總量/(種植前相同基質配比下的全磷總量+施肥加入的磷元素的量)╳10

Note:The values in the table represent the mean standard± error. N=4 for each treated sample of aboveground index,and n=3 for each treated sample of underground index. Different lowercase letters represent significant differences between different AMF under the same substrate at the 0.05 level. The proportion is the total amount of phosphorus input into the test system,that is,the total amount of total phosphorus under the same soil matrix before planting + the amount of phosphorus added by fertilization. Effective phosphorus proportion in the soil (%)=total effective phosphorus in the soil / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 100%;Aboveground phosphorus ratio (%)=total phosphorus of aboveground / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 100%;Underground part of phosphorus ratio (%)=total phosphorus of underground / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 100%;Phosphate ions proportion in leachate(%)=total phosphate ion in leachate / (total phosphorus before planting in the soil under the same soil matrix + phosphorus in fertilizer application) ╳ 10

表4 P元素的總量變化雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA analysis of P transport

注：黑色加粗字體為具有顯著相關性(P<0.05)或為極顯著相關(P<0.01)

Note：Bold black fonts were significantly correlated at the 0.05 level or very significantly correlated at the 0.01 level

3 討論與結論

由于大氣中P沉降到土地中的量非常低(<0.1 kg·ha-1·yr-1)，所以在陸地生態系統中土壤就成為植物以及土壤微生物主要的磷元素來源[11-12]。在本研究中，土壤基質以及外施化肥的P成為整個試驗體系中P元素的主要來源。

不同的土壤基質會影響土壤中磷的保持和流失，砂質土壤的淋溶是粘性土壤的10倍以上[13]。有研究表明，砂壤在淋洗前后基質表層(0～10 cm)中的有效磷從39.4 mg·kg-1降低到33.5 mg·kg-1，降幅為5.9 mg·kg-1；壤質土則從41.3 mg·kg-1降低到38.6 mg·kg-1，降幅僅為2.7 mg·kg-1；說明砂質土中速效養分吸持能力較弱[14]。本研究中試驗后2∶8ck、4∶6ck、6∶4ck基質中的有效磷總量相較于試驗前分別減少了29%，13%，20%。也反映出基質中砂含量越大，P元素越易流失。

有趣的是接種AMF能夠顯著的增加基質中有效磷的總量，2∶8Gm和2∶8Ri組有效磷總量相較接種前分別增加了約22%，25%，并且有效減少了基質中有效磷總量的流失，從一定程度上來看，AMF可以影響土壤和宿主植物中P元素總量和效率，AMF對P元素的影響至關重要。有研究表明，在磷轉運方面，AMF外生菌絲可以將無機磷轉化為多聚磷酸鹽，以多聚磷酸鹽的形式運輸到內生菌絲中，內生菌絲中的多聚磷酸鹽通過水解釋放無機磷到菌根細胞中，進而傳遞給宿主植物[15]；接種AMF的白三葉對根際土壤有效磷利用率相較于不接種組提高了48%[16]；對多花黑麥草與紅三葉分別接種Claroideoglomusclaroideum，Rhizoglomusirregulare和Funneliformismosseae，發現接種AMF能夠顯著增加紅三葉磷總量、總生物量以及多花黑麥草磷總量[17]。而且接種AMF可以增加宿主植物生物量[18-20]。這些研究結果不同程度上支持了我們的結論，土壤基質以及AMF侵染影響了試驗體系中P元素的流失和吸收，以及草坪草的生長；而且土壤基質和AMF之間的交互作用會共同影響基質中的有效磷、植物地上部磷、滲濾液中的磷酸根離子的總量。

但是，我們也發現AMF的作用并不具有普適性[21]。本試驗中在4∶6基質和6∶4基質中接種AMF，不但沒有增加基質中的有效磷總量以及植物地上部和地下部的磷，反而在6∶4基質中出現了下降的趨勢，6∶4Ri組有效磷總量相較于種植前基質中有效磷總量減少了37%。可能是由于一方面AMF受到了基質總體養分的影響，6∶4基質養分含量較高(見表1)，AMF接種效應不明顯所致。Yano等人[22]研究發現，在酸性土壤中(pH 4.2，粉壤土，9.4% 有機質)種植甘薯并接種Glomusmargarita后并不能改善其對P元素的吸收。suri等人[23]在酸性淋溶土基質(含砂20%，粉土45%，粘土34%)上種植小麥，并接種無梗囊霉屬與根內球囊霉屬AMF，也發現小麥對P元素的吸收并沒有顯著的改善。另一方面，AMF可能受到基質中P元素含量的影響，當土壤中P含量過高時，AMF活性降低，P吸收和轉運功能受到影響，從而影響土壤微生物的活性和豐度[24]，6∶4基質中P總量高于其它兩種基質，可能基質P總量過高，反而抑制了微生物的侵染率以及活性。另外，種植小麥并分別施入P25(25 kg·ha-1)，P100(100 kg·ha-1)的磷肥，在小麥生長的kernel dough階段測定根際AMF的侵染率，發現對照組與P25的總侵染率分別為43.56%，53.56%，而且二者顯著高于P100(23.95%)[25]。還有研究發現接種AMF的生菜在具有相對較高土壤堿解氮與速效磷的土壤中，生菜組織中的大量與微量元素總量均減少[26]?？梢姡寥镭汃さ臈l件下(低氮磷條件下)，AMF的作用更顯著，這也符合Latef等人[27]的觀點。同時，李芳等人[28]也提到AMF能夠在非生物脅迫條件下幫助宿主植物提高抗逆性。

綜上所述，建植基質中砂比例越高，養分(磷)越易流失，但AMF的作用就越明顯，本研究條件下2∶8土砂比基質中，接種Gm或Ri處理基質中有效磷的總量是ck組的1.71，1.76倍，而且滲濾液中磷酸鹽離子的總量是ck組的0.65，0.59倍，也就是說AMF在一定程度能夠通過增加基質中的有效磷含量并減少滲瀝液中的P，從而降低(抑制)了P元素的流失。依據研究結果，我們推薦在養分較為貧瘠的坪床中施用AMF，既可減少養分的流失，又可增加坪床基質中的有效磷含量。另外，本研究只選取了“蘭引3號”結縷草作為試驗對象，接種摩西管柄囊霉(Gm)，根內球囊霉組(Ri)，得到的結果仍有一定的局限性，不同坪床適宜的基質土砂配比，不同的草坪草種，接種哪些AMF菌劑更為適合等，還需要做大量細致的研究工作。