血漿循環腫瘤DNA與宮頸癌臨床病理、療效及預后的關系

廖麗川，孟以秀，向安玲，趙昌芹

(重慶市開州區人民醫院婦科，重慶 405400)

宮頸癌是目前世界范圍內最常見的婦科惡性腫瘤之一，有數據統計其發病率基本維持在334/10萬～555 /10萬人左右[1]。在我國，每年新發病例約10萬，占全世界新發病例總數的1/5，且近年有明顯上升趨勢，多呈年輕化，給女性生活和生命健康帶來極大威脅[2]。宮頸癌篩查是其主要診斷途徑，主要包括高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)、宮頸液基薄層細胞學檢查(TCT)、陰道鏡檢查及宮頸組織活檢等，但仍有部分患者覺得以上檢查繁瑣且有一定不舒適感而拒絕[3]。循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一種因實體腫瘤細胞凋亡或破裂而釋放進入外周循環系統的基因片段，主要存在于血液、腦脊液及滑膜液等液體中，具有與原發腫瘤組織一致的特性，提示了其在腫瘤診療中的價值[4-5]。近年，有研究發現ctDNA可真實體現不同治療手段下早期或晚期非小細胞肺癌腫瘤負荷變化，突出了其在惡性腫瘤診療中價值[6]。但關于其與宮頸癌臨床病理、療效及預后的關系的研究少見，具有一定探討價值。本文研究ctDNA在宮頸癌和正常女性中的差異，并探討其與宮頸癌臨床病理、療效及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年1月于重慶市開州區人民醫院診治的188例宮頸癌患者作為研究對象，命名為宮頸癌組。納入標準：(1)符合《婦產科學·八年制·第二版》[7]中宮頸癌診斷者；(2)國際婦產科聯盟(FIGO)分期[8]在I-III期者；(3)首次診斷者；(4)均接受手術或同步放化療治療者，且臨床資料完整者；排除診斷：(1)合并其它原發惡性腫瘤者；(2)入組前接受任何治療者；(3)有精神病史或家族史者。同時選取同期于本院體檢的200例健康女性為健康對照組。本研究所有研究對象均簽署知情同意書，并通過倫理委員會批準。宮頸癌組：年齡(49.16±6.35)歲；體重指數(BMI)(24.96±2.35)kg/m2；健康對照組：年齡(49.31±6.54)歲；BMI(24.42±2.12)kg/m2。兩組在年齡及BMI等一般資料上比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 抽取宮頸癌組治療前后和健康對照組5 mL空腹靜脈血于EDTA抗凝管中，充分混勻，2 h內以4 000 r/min 離心5 min分離血漿，并將其保存于-80 ℃冰箱中待集齊檢測。

1.2.2 檢測方法 主要分為兩步：第一，采用兩步磁珠法(北京臻和科技有限公司)提取血漿游離DNA， 具體參照操作說明書：準備一個干凈離心管，并向其中分別加入100 μL血漿、10 μL蛋白酶K、185 μL緩沖液、15 μL異丙醇和20 μL磁珠，漩渦振蕩，使其充分均勻以得到磁性分離，后將上清液移至新離心管，即得到純化游離DNA；第二，采用Nanodrops 2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)檢測游離DNA含量。采用受試工作者曲線(ROC)確定ctDNA高低表達臨界值：以ctDNA含量≥14.64為高表達(102例)；以ctDNA含量<14.64為低表達(86例)。

1.3 隨訪

本研究對宮頸癌組患者隨訪3年，收集患者3年無進展生存(progression free survival，PFS)和3年總生存(overall survival，OS)情況。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組ctDNA含量比較

宮頸癌組ctDNA含量為(15.76±3.18)ng/mL，高于健康對照組(7.82±1.63)ng/mL，差異有統計學意義(t=31.218，P=0.001)。

2.2 ctDNA與宮頸癌臨床病理的關系

ctDNA含量在組織學分級、浸潤間質深度、淋巴轉移及FIGO分期上差異顯著，有統計學意義(P<0.05)，以高分化、浸潤間質深度≥1/2、存在淋巴轉移及FIGO III期者為ctDNA高表達者居多，反之則為低表達者；但在年齡、腫瘤大小和是否累積子宮下段上差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 ctDNA與宮頸癌臨床病理的關系(%)

2.3 ctDNA與宮頸癌治療的關系

治療前宮頸癌 ctDNA含量為(15.76±3.18)ng/mL，治療后ctDNA含量(10.37±2.69)ng/mL，組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 ctDNA與宮頸癌預后的關系

隨訪3年，與高表達者比較，低表達者DFS生存率和OS生存率明顯增高(44.12%vs.62.79%；47.06%vs.67.44%)，差異有統計學意義(χ2=6.526,P=0.011；χ2=7.883，P=0.005)。見圖1。

2.5 影響宮頸癌預后的多因素COX回歸分析

經多因素COX回歸分析得知，有淋巴轉移、FIGO III期和ctDNA高表達是影響宮頸癌預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響宮頸癌預后的多因素COX回歸分析

賦值：組織學分級(中低分化=1；高分化=0)、浸潤間質深度(≥1/2=1；<1/2=0)、淋巴轉移(是=1；否=0)、FIGO分期(I=1；II=2；III=3)、ctDNA含量(高表達=1；地表達=0)。

3 討論

近年，我國醫療技術進步迅速，宮頸癌診療技術提高是其重要體現之一，但其死亡率仍居高不下[9]。究其原因，大部分學者認為這與腫瘤異質性有關，這是在腫瘤發展過程中，腫瘤細胞歷經數次分裂和增殖后，其子代在基因組、蛋白組及表觀遺傳學上發生變化，最終造成其在增殖、轉移、侵襲、治療及預后上各具差異[10-11]。目前關于腫瘤異質性的檢測主要包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)、播散腫瘤細胞(disseminated tumor cell,DTC)及ctDNA等，為患者精準治療打下堅實基礎[12]。近年ctDNA研究火熱，研究發現，ctDNA核酸序列與腫瘤組織樣本來源腫瘤特異性核酸序列高度一致[13]；而ctDNA在不同癌癥類型和同一癌癥類型不同個體之間差異較大，在同一個體中，可隨“腫瘤負荷情況”及疾病嚴重程度變化，高濃度ctDNA即預示著惡性程度高、腫瘤晚期或不良預后[14-15]。

在本研究中，通過對比分析188例宮頸癌患者和200例健康體檢女性血漿ctDNA含量發現宮頸癌血漿ctDNA含量明顯高于健康人群，與國內外主流意見基本一致[16-17]，提示血漿ctDNA檢測對宮頸癌診斷可能具有一定價值。此后，本研究還探討了血漿ctDNA與宮頸癌臨床病理特征之間的關系，發現其在高分化、浸潤間質深度≥1/2、存在淋巴轉移及FIGO III期患者中為ctDNA高表達者(P<0.05)，而在不同年齡、腫瘤大小及是否累積子宮下段上差異不明顯(P>0.05)，提示其可作為臨床病理特征的參考指標，為手術醫師術前評估腫瘤情況提供依據。此外，本研究還探討了血漿ctDNA與宮頸癌治療療效及預后之間的關系，發現與治療前比較，治療后宮頸癌患者血漿ctDNA含量明顯降低(P<0.05)，說明其對患者治療療效評估可能有一定參考價值，這是因為ctDNA含量在一定程度上可提示腫瘤負荷變化，從而反映治療效果。隨訪3年，與血漿ctDNA高表達者比較，低表達者DFS生存率和OS生存率明顯增高(P<0.05)，提示血漿ctDNA與宮頸癌預后密切相關。眾多研究表明，治療前ctDNA是影響腫瘤預后的獨立危險因素，以非小細胞肺癌、乳腺癌及卵巢癌等中較為多見[18]，但在宮頸癌預后中的評估價值尚不明確。本研究前述提示ctDNA與宮頸癌預后密切相關，具體價值尚不明確，為此本研究進行了預后影響因素的多因素COX回歸分析，發現有淋巴轉移、FIGO III期和ctDNA高表達是影響宮頸癌預后的獨立危險因素，前面兩者是臨床較為成熟的結論，而后者則為宮頸癌預后評估提供了新的方向，為提高預后評估準確率作出了貢獻。

綜上認為，宮頸癌患者中血漿ctDNA含量較高，在不同組織學分級、浸潤間質深度、淋巴轉移及FIGO分期等臨床病理特征上差異明顯，與治療及預后相關，有望成為宮頸癌臨床診療及預后檢測的有效指標。但至今為止，血漿ctDNA檢測技術仍是影響臨床推廣的重要原因，提高檢驗技術是后續研究的重點之一。