血管通透因子、DCC基因及MMP-9蛋白在胃癌患者中的表達水平研究

李程亮，辛宏，王敏娟，石穎鵬

(西安醫學院第一附屬醫院全科醫學科，陜西 西安 710077)

胃癌是臨床上較為常見的消化系統惡性腫瘤，在我國常見的惡性腫瘤中，胃癌發病率一直居于前列[1]。據世界衛生組織統計數據顯示，全球范圍內每年會有接近100萬的胃癌死亡病例，嚴重威脅著患者的生命安全。絕大多數胃癌患者早期無明顯癥狀，這也導致了目前我國胃癌的早期診斷率相對較低，因此如何提高胃癌早期診斷率是當前許多學者主要的研究課題[2]。血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)作為一種誘導能力很強的因子，能夠刺激細胞的增殖、遷移，在腫瘤的形成中起到重要的作用；基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)蛋白能為癌細胞的轉移創造條件，在腫瘤細胞轉移過程中發揮重要作用[3-4]；結直腸癌缺失 (deleted in colorectal cancer，DCC)基因是目前臨床上發現的最長的抑癌基因。本研究對VPF、DCC及MMP-9在胃癌癥狀中的表達進行分析研究，旨在研究三者與胃癌癥狀發病的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年3月至2018年3月在西安醫學院第一附屬醫院檢查確診并進行手術治療的胃癌患者50例，其中包括男性30例，女性20例，年齡40～75歲，平均年齡(58.3±5.8)歲，腺癌患者18例，腺鱗癌患者16例，鱗癌患者13例，其他3例。排除標準：病歷資料不全患者；并發其他類型惡性腫瘤患者；接受過放療、化療治療的患者；心腦血管疾病患者；精神疾病患者。所有研究對象及家屬均知情同意，并獲得本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 取所有患者手術切除癌組織標本以及與癌組織距離5 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織，使用4%中性福爾馬林對所采集的標本進行固定，并進行常規石蠟包埋，之后進行連續切片作免疫組化標記以及革蘭染色待用。

1.2.2 免疫組化染色處理 將待測標本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修復液，在37 ℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的H2O2，去過氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用PBS淋液沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS淋液沖洗；經過DAB顯色處理10 min，能夠在顯微鏡下觀察到棕黃色陽性反應，則采用PBS淋液沖洗1 min；使用蘇木精復染3 min，然后用濃度為1%的鹽酸乙醇分化處理，自來水沖洗1 min后，脫水并封片處理。

1.2.3 酶聯免疫吸附法檢測VPF表達 將待測的標本和酶標物嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟與和固相載體產生反應作用，將固相載體反應的復合物經過洗滌與其他物質分離，加入酶反應底物，經過酶的催化作用形成有色物質，根據顏色的深淺進行定性或定量分析VPF的表達。

1.2.4 熒光定量RT-PCR檢測DCC基因表達 采用熒光定量RT-PCR技術進行檢測，嚴格按照定量PCR儀的操作說明書進行。依次加入2.5 μL的稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2溶液，0.5 μL上游引物和下游引物，最后加水配成總體積為25 μL的反應體系。在94 ℃環境中反應1 min；55 ℃環境中反應1 min；72 ℃環境中反應1 min，進行35個循環，72 ℃環境中反應延長5 min，重復最少3次。采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的DCC基因。

1.2.5 Western blot檢測MMP-9蛋白表達 將待測標本使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細胞裂解液，進行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V，電泳10 min，結束之后，將電轉膜浸泡在10%的牛奶中，在37 ℃環境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結合，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗Tubulin(內參照)，在4 ℃的環境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復清洗。最后，加入顯影劑將其在底物溶液中進行顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行，采用目的蛋白條帶分析灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 癌旁組織、癌組織病理組織學觀察

如圖1所示，癌旁組織細胞排列較為緊密，大小均勻，形態一致，細胞核圓潤，無核分裂現象；胃癌組織細胞大小不等，排列較為紊亂、疏松、不規則，細胞核形態多樣，多有核分裂現象。

2.2 癌組織與癌旁組織中VPF、DCC及MMP-9表達對比

如表1所示，癌組織中VPF、MMP-9陽性表達率顯著高于癌旁組織，DCC基因陽性表達率顯著低于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1癌組織與癌旁組織中VPF、DCC及MMP-9表達對比[n(%)]

組別VPFDCCMMP-9癌旁組織(n=50)4(8.00)47(94.00)3(6.00)癌組織(n=50)29(58.00)40(80.00)28(56.00)t值28.274.3329.22P值<0.05<0.05<0.05

2.3 VPF、DCC及MMP-9陽性表達的相關性分析

如表2所示，胃癌患者VPF、DCC及MMP-9陽性表達率與性別、年齡無關，與病理分期、淋巴結轉移情況、腫瘤體積、浸潤程度以及分化程度有關，Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴結轉移、腫瘤體積較大、侵及漿膜以及分化程度較高的患者VPF、MMP-9陽性表達率較高，DCC基因陽性表達率較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 VPF、DCC及MMP-9陽性表達的相關性分析[n(%)]

3 討論

胃癌是一種臨床上較為常見的惡性腫瘤，起源于患者胃黏膜上皮，是人體消化系統中最常見的惡性腫瘤[5]。胃癌發病率在我國一直居高不下，并且隨著社會發展，人們生活節奏不斷加快，飲食不規律，導致胃癌癥狀發病率不斷提升，嚴重影響著人們的生活質量及生命安全[6]。

據相關流行病學調查結果顯示，胃癌的主要危險因素包括吸煙飲酒、不健康食品以及胃病史和家族史等，目前診斷胃癌的公認標準依舊是胃鏡活檢，但是使用該方法檢測出胃癌時，癌細胞很可能已經發生轉移。絕大多數胃癌患者早期無明顯癥狀，這也導致了目前我國胃癌的早期診斷率相對較低，因此如何提高胃癌早期診斷率是目前大多數學者主要的研究課題[7-8]。隨著臨床診斷技術的不斷進步，血清指標及腫瘤標志物檢測逐漸應用于胃癌患者的診斷中，臨床中有價值的腫瘤標志物有很多，如糖鏈抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)等。但是，這些腫瘤標志物在多種惡性腫瘤中均會呈現異常表達，因此對于胃癌癥狀的臨床檢測特異性較低，診斷效能也不理想[9-10]。

VPF又稱血管內皮生長因子[11]，是一種促血管內皮細胞生長因子，具有高度的特異性，能提高人體血管的通透性，且能夠一定程度上促進細胞外基質變性以及血管形成，是近年來臨床上確定的一種具有旁分泌機制的血管生成因子[12]。VPF作為一種具有較強誘導能力的因子，能夠特異性地作用于血管內皮細胞，刺激細胞的增殖、遷移以及誘導血管的生長，在腫瘤的血管形成過程中起到重要的參與作用，徐鋮等[13]通過研究發現血管通透因子在胃癌患者體內呈現高表達。VPF是腹膜轉移的一種重要的預測因子，在臨床上較為常見的惡性腫瘤的相關研究中，均發現了VPF的較高表達。李君強等[14]研究提出，如果腫瘤組織大部分出現壞死，產生的VPF腫瘤細胞會減少；如果出現缺血和缺氧的誘導因素，也不會生成太多的VPF，患者血清中的VEGF水平也會降低。相反情況下，如果大多數的腫瘤組織處于缺血和缺氧的環境下，其程度達不到腫瘤組織壞死的程度時，腫瘤組織會在缺血和缺氧的誘導下生成大量的VPF，患者血清中的VPF濃度也隨之上升。本研究對胃癌患者血清VPF水平進行了檢測，結果顯示，在胃癌癥狀中，血清VPF陽性表達率較高，說明VPF參與了胃癌的發生及發展過程，與胃癌癥狀的發展程度具有一定的相關性。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)是一組內肽酶，主要依賴于鋅離子，其中成員分子量大小不同，底物也不完全相同[15]。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族的一種，其作為一種Ⅳ型的膠原蛋白，主要作用是降解細胞外基質，還能夠降解明膠、纖維結合素、彈性蛋白等[16-17]。楊云鵬等[18]研究發現，MMP-9對Ⅳ膠原蛋白產生破壞，降解細胞外基質從而促進胃癌細胞發生上皮間充質轉化，轉移到臨近其他健康組織中，為胃癌細胞的轉移創造條件，在胃癌細胞轉移過程中發揮重要作用。本研究中對胃癌組織中MMP-9表達進行檢測，結果顯示在胃癌組織中MMP-9蛋白陽性表達率較高，說明MMP-9蛋白水平與胃癌癥狀的發生及發展有著密切的聯系，與張靜怡等[19]的研究結果一致。DCC基因是上個世紀發現的一種抑癌基因，近年來有許多專家學者通過實驗研究證明了DCC基因在結直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中呈現較低表達，但是關于其與胃癌癥狀關系的報道相對較少。張躍等[20]通過研究表明，DCC基因具有誘導腫瘤細胞凋亡，若人體DCC基因水平出現異常，很有可能會出現細胞惡變。本文研究結果還發現，胃癌患者DCC基因水平出現明顯的下降，可能是由于DCC基因出現異常表達，導致細胞惡化，說明DCC基因水平與胃癌發生發展有密切聯系。

綜上所述，血清VPF、DCC基因及MMP-9蛋白水平在胃癌癥狀中呈現異常表達，且具有一定相關性，為胃癌的臨床診斷提供一定的價值幫助。