檞皮素在非小細胞肺癌中的應用研究

張莉莉，谷俊，董媛

(1.西電集團醫院呼吸血液腫瘤科，陜西 西安 710077；2.陜西中醫藥大學附屬醫院呼吸二科，陜西 咸陽 712000；3.西安交通大學醫學院附屬紅會醫院控感辦，陜西 西安 710054)

目前，全世界的肺癌發病率及死亡率均高居不下，且發病率一直呈上升趨勢。我國屬于肺癌的高發國家[1-2]，發病人群主要為老年人，年齡大部分集中在65～75歲[3]，每年因肺癌死亡的人數占全部惡性腫瘤死亡人數的20%～25%[4]，其中因非小細胞癌死亡的人數占所有肺癌死亡人數的80%[5]。因此，為提高腫瘤的臨床診斷技術，對腫瘤發生的分子機制和發現特異的腫瘤相關分子必須予以高度關注。然而，目前非小細胞肺癌的發生發展的具體環節及機制尚未完全清楚。

檞皮素是一種具有多種生物活性且無毒副作用的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜及中草藥中。黃酮類化合物是中藥的有效成分，具有活血化瘀的功效。因此推測檞皮素對肺癌的治療可能有一些功效。此外，檞皮素還具有較強的抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖的作用[6-7]。近年來，研究發現檞皮素的藥理作用廣泛[8]，對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用，其抗腫瘤活性越來越引起研究者的關注。因此，本研究擬通過非小細胞肺癌細胞體外培養來研究檞皮素對其活性的影響機制，為非小細胞肺癌的治療提供可能的參考，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本采集

臨床標本來源于2016年3月至2018年10月武漢協和醫院胸外科接受外科手術治療的非小細胞肺癌患者44例。納入標準：有詳細的臨床病理資料；臨床樣本均經過兩名有經驗病理醫師診斷確認；病理分型為鱗癌和腺癌；患者均為初次治療，術前均未接受放療和化療。排除標準：認知功能障礙者；合并其他嚴重的心肝肺功能障礙、腫瘤者；免疫缺陷者。其中男性26例，女性18例，平均年齡(55.6±7.0)歲；鱗癌20例、腺癌24例；TNM分期為I期13例、II期19例、III期7例、IV期5例。取手術中的病理組織，原代分離細胞，常規培養，檢測非小細胞肺癌細胞中miR-16和HOXA10表達情況，觀察檞皮素對非小細胞肺癌細胞活力的影響。

1.2 miRNA-16和HOXA10的檢測

采用TriZol試劑提取各臨床分期的非小細胞肺癌細胞中的總RNA，采用實時定量PCR法檢測細胞中miRNA-16和HOXA10的表達。

1.3 細胞活力檢測

采用CCK-8法檢測轉染細胞的活力。將細胞以每孔2×103個細胞接種于96 孔板上，于37 ℃及5% CO2恒溫培養箱中培養，待藥物作用后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在酶標儀上檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，實驗重復3次，計算各組細胞的存活率。

1.4 檞皮素對非小細胞肺癌細胞活力的影響

參照文獻報道[1]，采用50 μmol/L的檞皮素作用于非小細胞肺癌細胞48 h后，分別檢測作用前后miRNA-16和HOXA10表達和細胞活力變化。

1.5 檞皮素對非小細胞肺癌細胞凋亡率的影響

50 μmol/L檞皮素作用48 h后，每孔加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光室溫反應15 min，加入300 μL結合緩沖液，立即經流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 不同臨床分期的非小細胞肺癌細胞中miRNA-16和HOXA10的表達水平比較

非小細胞肺癌細胞中miRNA-16和HOXA10的表達水平隨著患者的臨床分期增加而不斷增加，差異具有統計學意義(P<0.001)。見表1。

組別Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)miRNA-160.124±0.060.236±0.06?0.454±0.08?#0.634±0.10?#△HOXA100.187±0.040.332±0.05?0.632±0.09?#0.823±0.11?#△

*P<0.01，與Ⅰ期比較；#P<0.01，與Ⅱ期比較；△P<0.01，與Ⅲ期比較。

2.2 檞皮素作用于不同臨床分期的非小細胞肺癌細胞后細胞中miRNA-16和HOXA10的表達水平

在檞皮素作用下，非小細胞肺癌細胞中miRNA-16和HOXA10的表達水平在各組臨床患者中均有所下降，且與作用前相比差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

時期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)miRNA-16作用前0.124±0.060.236±0.060.454±0.080.634±0.10miRNA-16作用后0.083±0.08?0.132±0.05?0.258±0.09?0.442±0.09?HOXA10作用前0.187±0.040.332±0.050.632±0.090.823±0.11HOXA10作用后0.114±0.02?0.237±0.04?0.455±0.06?0.671±0.09?

*P<0.01，與作用前比較。

2.3 檞皮素作用下不同臨床分期的非小細胞肺癌細胞活性變化

細胞活力測試顯示，檞皮素作用后臨床Ⅰ期-Ⅳ期細胞存活率均顯著低于作用前(P<0.05)。見表3。

時期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)作用前101.41±6.42114.50±10.51139.20±11.90155.15±15.32作用后78.31±6.21?81.67±8.19?90.91±12.54?100.32±12.53?

*P<0.01，與作用前比較。

2.4 檞皮素對非小細胞肺癌細胞凋亡率的影響

檞皮素作用后臨床Ⅰ期-Ⅳ期非小細胞肺癌細胞凋亡率均顯著高于作用前(P<0.05)。見表4。

時期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)作用前5.89±1.125.78±1.155.79±1.345.88±1.25作用后12.56±4.07?13.21±4.13?13.65±4.16?15.34±4.21?

*P<0.01，與作用前比較。

3 討論

目前非小細胞肺癌的治療手段主要以手術、放療、化療和靶向治療為主，非小細胞肺癌在臨床上最為常見，發病率和死亡率均居高不下，但發病機制目前尚不明確，因此，為減輕患者放化療的不良反應，延長患者的生存期，有中醫醫師提出以辨證論治為基礎，運用中醫藥的方法來有效控制肺癌疾病的進展[9]。許玲等[10]應用人肺腺癌LAX-83裸小鼠模型觀察益肺抗瘤飲(主要含黃芪、北沙參、天冬、女貞子、七葉一枝花等)對肺癌細胞增殖的抑制作用，發現益肺抗瘤飲可降低Ki-67的陽性率，并降低C-myc蛋白的表達，益肺抗瘤飲可通過改變肺癌基因表達來抑制肺癌細胞的增殖。檞皮素作為一種黃酮類的中草藥有效成分，其對肺癌的作用機制還尚未徹底闡明。

目前，很多研究表明檞皮素對多種腫瘤細胞均存在一定的抑制作用，具有抗炎、抗氧化、擴張血管作用，其抗腫瘤的活性得到了廣泛的關注[11]。自然界中具有豐富的檞皮素資源，主要以糖苷的形式存在于植物中，含量豐富，且檞皮素的藥理作用廣泛而強大，存在于蔬菜、水果及中草藥之中，便于提取，分離和利用[12]。在抗肺癌的研究中，發現檞皮素能夠促進肺癌細胞NCL-H460凋亡，且隨著藥物的濃度增加凋亡率也在增加[13]，說明檞皮素在肺癌細胞的凋亡中發揮著重要作用，可能與激活下游的信號通路有關。miR-16作為一種與腫瘤發生密切相關的miRNA，位于DLEU2基因的內含子區域，其低水平能夠抑制腫瘤的遷移和侵襲，是肺癌患者預后的獨立危險因素[14]。胃癌、乳腺癌、胰腺癌等中均可見miR-16的表達下調[15]。HOXA10是同源盒(HOX)基因家族中的一員，在調節癌癥的發生發展中起到了重要的作用。目前的研究發現乳腺癌、子宮內膜癌、口腔癌等多種癌組織中均有HOXA10的過度表達[16]。因此，本研究將miR-16和HOXA10作為非小細胞癌檢測的標記物。

本次研究結果顯示，在非小細胞肺癌Ⅰ期-Ⅳ期患者中，miR-16和HOXA10的表達水平隨著患者的臨床分期增加而不斷增加，說明miR-16和HOXA10的表達水平與疾病的嚴重程度呈正相關。提示非小細胞肺癌的發生與miRNA-16和HOXA10的過度表達有關。在檞皮素作用下，非小細胞肺癌細胞中miR-16和HOXA10的表達水平在各組臨床患者中均顯著低于作用前，說明檞皮素能夠抑制miR-16和HOXA10的表達。檞皮素作用后臨床Ⅰ期-Ⅳ期非小細胞肺癌細胞存活率顯著低于作用前臨床Ⅰ期-Ⅳ期細胞存活率，且Ⅰ期-Ⅳ期非小細胞肺癌細胞凋亡率均顯著高于作用前。表明檞皮素能夠抑制非小細胞肺癌腫瘤細胞的細胞活力，促進非小細胞肺癌癌細胞的凋亡，而這一作用可能是通過抑制miR-16和HOXA10的表達完成，推測可能是由于檞皮素通過調控miR-16/HOXA10軸抑制了非小細胞肺癌細胞的活性。本研究結果也提示，miR-16和HOXA10可能是一種抑癌基因，與在其它系統的腫瘤疾病的研究結果一致。

綜上所述，非小細胞肺癌細胞中miR-16和HOXA10的表達水平隨著患者的臨床分期增加而升高。檞皮素能夠有效抑制miR-16和HOXA10的表達，對各個時期非小細胞肺癌細胞均有抑制效果。檞皮素能夠降低抑制非小細胞肺癌細胞的活性，增加其凋亡率。因此miR-16和HOXA10的表達水平異常升高可能是非小細胞肺癌發病中的重要環節之一。

本研究存在一定的不足，非小細胞肺癌占肺癌的大多數，細胞類型也很多，但此次研究所涉及的細胞類型較單一，而且 miRNAs是一大類RNA，其所能調控的靶mRNA也紛繁復雜，需要進一步研究，如多種類型的納入，更多病例的檢測及進一步臨床驗證等。