植物多酚與蛋白質互作機制表征方法研究進展

李春翼，田勇，楊雅軒，李葦舟，趙吉春,2，李富華,2，明建,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶,400715)

多酚化合物是植物細胞中一種具有苯環上連接多羥基基團結構的化學物質統稱。由于多酚化合物對人體健康有一定的促進作用，特別是在預防慢性疾病方面具有較好的效果[1]，已成為食品營養學研究的熱點。科學研究證實，多酚化合物的多羥基能與蛋白質、多糖、生物堿、微生物、金屬等結合[2-4]。在食品加工和人體消化過程中，多酚化合物能與蛋白質大分子發生相互作用，進而影響2類物質的功能活性和結構特征。因此，本文綜述了多酚與蛋白質相互作用機制以及表征方法，以期為多酚/蛋白質復合體系在食品工業中的應用提供理論依據。

1 植物多酚與蛋白質相互作用機制

多酚與蛋白質相互作用通過可逆或不可逆的2種方式形成。多酚與蛋白質之間可逆相互作用主要是由氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用或范德華力等非共價作用力形成[5-7]；多酚與蛋白質的不可逆相互作用是由共價鍵作用力形成[8-9]。

1.1 非共價相互作用機制

研究證實，植酸和牛血清白蛋白(Bovine albumin, BSA)相互作用的結合力主要是靜電[5]。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)與蘆丁(Rutin,R)相互作用主要是氫鍵和疏水相互作用[6]。范德華力和氫鍵在黃芩素與酪氨酶結合中起到主要作用[7]。多酚與蛋白質相互作用的非共價機制如圖1所示[10]。

圖1 多酚與蛋白質非共價相互作用機制[10]Fig.1 Mechanisms of non-covalent interactions between polyphenols and proteins

1.2 共價相互作用機制

共價相互作用是多酚與蛋白質相互作用中最重要的方式，因為它不可逆地影響2類物質的性質。PRODPRAN研究發現多酚與肌原纖維蛋白發生共價交聯，使游離氨基含量較大程度地降低與肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)的條帶強度，證實了多酚對大鯛魚肌原纖維蛋白性質產生較大的影響[8]。SUI[9]也證實了花青素與大豆蛋白之間共價鍵的存在。目前，普遍認為多酚與蛋白質共價相互作用機制主要是鄰醌形成機制：多酚化合物由于其高度反應性而易被氧化或自動氧化生成相應的鄰醌或半醌，然后進一步與蛋白質的側鏈賴氨酸或半胱氨酸殘基等共價結合[11]。圖2為多酚與蛋白質共價相互作用機制示意圖[12]。

圖2 EGCG通過自動氧化與蛋白質半胱氨酰巰基結合的機制[12]Fig.2 Proposed mechanism for EGCG binding to a protein cysteinyl thiol group through autoxidation

2 植物多酚與蛋白質互作機制的表征方法

由于多酚與蛋白質相互作用非常復雜，解析其作用機制必須借助光譜、質譜、顯微等技術。通過獲得的特征參數如特征光譜系數、結合常數、親和力指數及空間結構變化等[13]，解析多酚與蛋白質之間的互作機制。本文從光譜學、波譜學、量熱技術、結構化學和其他技術對植物多酚和蛋白質互作機制表征的方法進行了分類闡述。

2.1 光譜學技術

2.1.1 熒光光譜法

熒光光譜法廣泛應用于多酚與蛋白質相互作用的研究中，其中熒光猝滅法是確定多酚與蛋白質相互作用結合位點數與結合常數的一種簡單適用技術手段[14]。由于苯丙氨酸(Phe)的量子產率很低，酪氨酸(Tyr)能被電離或在靠近羧基、氨基時其熒光幾乎全部猝滅[15]。因此，一般利用色氨酸(Trp)為熒光探針來研究蛋白質分子的構象以及與小分子/阿魏酸(FA)/表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)之間的相互作用。酪氨酸酶的熒光強度隨著黃芩素的添加而減弱，猝滅類型為靜態和動態猝滅[7]。3種多酚對β-LG熒光強度的淬滅能力為EGCG>綠原酸(CGA)>FA[15]。

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜法(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)

蛋白質酰胺帶的紅外光譜可提供其二級結構信息，特征吸收帶主要有酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶，因酰胺I區域信號強而被廣泛使用[17]。酰胺I帶能給出蛋白質的α-螺旋(1 650～1 658 cm-1)、β-折疊(1 610～1 640 cm-1)、β-轉角(1 660～1 695 cm-1)和無規卷曲(1 640～1 650 cm-1)等多種結構信息[18]，其紅外吸收峰的變化反映了蛋白質特定二級結構的變化。SUI研究認為大豆蛋白與花青素復合后[9]，β-折疊含量顯著下降，而β轉角和無規卷曲含量顯著增加，表明β-折疊轉變為β-轉角和無規卷曲。ZOU研究認為玉米醇溶蛋白(zein)與單寧(T)復合后[19]，使蛋白在1 657 cm-1處的吸收峰與T在1 614 cm-1處的吸收峰發生了重疊，并且在3 356 cm-1處出現了新的吸收峰。

2.1.3 拉曼光譜法

拉曼光譜[20]因其具有簡單、快速、可靠的優點，被廣泛用于食品的分析檢測中，其本質上屬于分子光譜，拉曼譜線的長度、數目和位移大小與樣品分子的振動和轉動相關，因此拉曼光譜可獲得分子的振動和轉動信息，為物質鑒定及結構研究(如紅外光譜)提供補充信息。LIU研究發現表面活性劑鼠李糖脂和復合物的拉曼光譜均觀察不到較明顯的峰[21]，而姜黃素(curcumin, Cur)在1 625，1 599，1 428，1 316和1 248 cm-1處出現強峰，白藜蘆醇在1 628，1 602，1 348，1 303，1 261，1 207，1 154，995 cm-1處有峰出現，這可能是由多酚濃度減少或者多酚與周圍基質的相互作用引起的。XU等研究發現三價鐵(5 μmol/L)的添加使絲蛋白(silk fibroin, SF)酰胺I帶的峰值由1 660 cm-1變為1 670 cm-1[22]。當EGCG存在時，SF酰胺I帶的峰值不受三價鐵的影響，維持在1 660 cm-1處。

2.1.4 圓二色譜(circular dichroism, CD)

圓二色性是由左右圓偏振光吸附的差異引起的，在測量時，波長的函數為二色性時即可得到圓二光譜，蛋白質的遠、近紫外CD譜可分別用于觀測蛋白質二、三級結構變化[23-24]。β-LG與多酚結合后其二級結構由α螺旋向β結構轉變，伴隨著β-轉角和無規則卷曲的輕微增加[16]。GUO等研究發現當黃芩素與酪氨酸酶的摩爾比為4∶1時[7]，α-螺旋的含量下降了3.67%，β-鏈的含量增加了3.33%，而β-轉角和無規線圈則無明顯變化。

上述4種表征方法的優缺點及應用見表1。

2.2 波譜學技術

2.2.1 核磁共振光譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)

NMR通過檢測分子結構中標記的碳元素的化學位移，直接表明多酚與蛋白質是否發生結合作用或間接表明相關構象的改變[27]。多酚-蛋白質相互作用的所有結合位點都與特定NMR峰相關，13C-NMR為蛋白質配體之間競爭位點特異性分析研究的有力工具，NMR可精確識別結合位點信息，解釋相互作用機理，分析相互作用構效關系，但也存在著檢測靈敏度較低、需樣量大、易受溶劑影響、對樣品濃度和穩定性要求較高、圖譜解析復雜等問題[28]。DELIUS[29]研究發現EGCG和表兒茶素-3-沒食子酸酯(ECG)的半最大結合常數BC50分別為0.2和0.3 μmol/L，與唾液黏蛋白的結合力最強，其余4種多酚與黏液蛋白的結合力大小為：表沒食子兒茶素(EGC)>表兒茶素(EC)>沒食子酸甲酯(EG)>R。

表1 多酚與蛋白質相互作用常見表征方法的優缺點及應用Table 1 Advantages, disadvantages and applications of common characterization methods of interaction between polyphenols and proteins

2.2.2 表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)

SPR的原理是根據表面等離子體與消逝波發生共振，表面介質折射率不同會引起共振波長、共振峰位置以及共振角的不同，從而實現待測物的檢測。SPR測定能夠提供分子間相互作用的親和常數和反應動力學，以及分子溶液中的活性濃度，且SPR具有高選擇性，實時檢測，需樣量少，不需標記反應物，靈敏度高等優點，但商業化的儀器成本較高，檢測極限較高，吞吐量較低[30-31]。其工作原理如圖3所示[32]。

PARK等[33]使用SPR研究了從構樹中提取的多酚化合物與冠狀病毒蛋白酶動力學結合參數，結果表明木犀草素A顯著地增加了SPR傳感，且呈現劑量依賴效應。

圖3 SPR儀器的原理(左)和典型的SPR傳感圖(右)[32]Fig.3 The principle of SPR instrument (left) and typical SPR sensorgram showing the steps of an analytical cycle (right)

2.3 量熱技術

2.3.1 等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC)

ITC主要用于檢測多酚與蛋白質相互作用過程中的熱力學變化，可得到如親和力、熵、焓、比熱容以及化學計量學的信息，ITC可以直接和定量測量多酚與蛋白質之間的相互作用及其對多酚/蛋白質結構的影響[23]。其靈敏度高、重復性好，為在線無損檢測，可一次性測定所有結合參數，不受沉淀影響，但加熱效應弱、測試耗時、需樣量大，難以確定大粒徑蛋白質結合位點[34]。KASPCHAK等[5]探討了加熱和不同離子強度條件下BSA與植酸、T的相互作用，發現植酸與BSA相互作用主要受靜電力支配，隨著離子強度的增加，兩者的結合下降，而溫度表現出相反的效果；T與BSA的結合隨著溫度的增加而增加，離子強度的下降而增加。

2.3.2 差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)

熱分析被廣泛用于聚合物的表征,當體系放熱、吸熱或者熱容量發生改變時，DSC能獲得涉及到的物理化學變化定性或定量信息，獲得動力學數據。DSC分析具有靈敏度高，操作簡單快速，適用性廣，樣品使用量少、無需前處理等優點，但也存在著成本高，當樣品量少、材料不均勻時不能很好代表整體[35]等問題。SUN等[36]分別從3種茶(綠茶、黑茶和烏龍茶)中提取多酚，并將其加入到豬胰α-淀粉酶(PPA)中，DSC結果表明，3種茶多酚的加入使PPA的ΔH和變性溫度降低，且隨著茶多酚濃度的提高，PPA的熱穩定性下降。對于8種多酚標品，T、ECG、EGCG和茶黃素-3,3’-二乙醇酸鹽能使PPA的ΔH和變性溫度變小，而茶黃素、茶黃素3’-沒食子酸酯、EGC和EC對PPA的ΔH和變性溫度無明顯影響。

2.4 結構解析技術

2.4.1 原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)

AFM是在掃描隧道顯微鏡基礎上研制而成的一種掃描探針顯微鏡，通過探針與被測樣品之間的微相互作用(原子力)獲得物質超微結構及表面信息，進而對樣品表面結構進行觀察。AFM不僅可以測定物質在原子或分子水平上的表面特征，而且可以測定極微弱的相互作用(皮克牛頓/pN級)，研究分子間的相互作用，常用于表征多酚與蛋白質的相互作用。AFM能提供三維表面圖，樣品制備簡單、無需覆蓋導電薄膜，成像和力分辨率高，但成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大[37-38]。SUN等研究發現當Cur加入到zein與蟲膠的復合顆粒中時[39]，在復合顆粒的AFM圖像中觀察到明顯不同的形態，三元體系表現出一種含多個直徑范圍(0.64～1.89 μm)的微球網絡結構，表明Cur摻入形成了形狀不規則的大尺寸聚集體。

2.4.2 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)

目前SEM分辨力為6～10 nm，通過電子束射到樣品表面產生次級電子，次級電子富集后轉變成電信號,從而得到表面結構的立體掃描圖像、微觀形貌放大像、表面組成分布、晶體的晶向和晶格常數、發光性試樣的結構缺陷等。在進行SEM觀察時樣品制備容易，耗時少，并可做綜合分析，放大倍數范圍廣，場深大。但SEM的分辨率有限[40-41]。T與BSA的復合物是具有良好組織結構的大團聚體，經煮沸后呈現無孔隙穿孔的結構；而植酸-BSA復合物組織結構較差，呈現不均勻、脆的形態[5]。

2.4.3 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)

LSCM[42]是一門20世紀末發展起來并逐漸得到廣泛應用的技術，可對固定的組織或活體樣本進行亞細胞水平結構分析。相較于常規的光學顯微鏡，LSCM的主要特點是通過共焦光學消除不需要的焦點外散射光，增強樣品的焦點內區域的對比度。CLSM具有較高精度，能夠3D成像，噪聲比得到改進，且對試樣無特殊要求，通過光散射減少圖像模糊性，缺點是分辨率較SEM低，成本高[43-44]。ZOU等研究發現，在zein-單寧復合顆粒制備的乳液中能夠觀察到油滴周圍的界面蛋白質網絡[19]。

2.5 其他技術

2.5.1 分子對接

分子對接[45]是一種通過計算，從而實現模擬分子間相互識別的方法，可確定配體與靶結合位點的結合構象和最佳位置、方向。剛性對接速度快，柔性對接構象可轉換，但難以選擇正確的結合位點，對接軟件的準確性不夠，匹配算法和評分方案較難確定，且剛性對接缺乏實際應用，柔性對接耗時較長，需計算吞吐量[46]。R與β-LG有2個最可能的結合位點，位點1位于β-LG的內腔，主要作用力為疏水相互作用；位點2則位于邊緣，具體示意圖如圖4所示[6]。LI等[47]為深入探討4種黃酮類化合物(芹菜素、柚皮苷、山奈素和金雀異黃素)與β-LG的相互作用，發現β-LG與疏水配體有3個結合位點，因位點2生成的構象最穩定且能量最高，因此位點2被認為是β-LG與配體結合的最適位點。

A-利用SiteMap預測結合位點1和2；B-位點2的曲面表示；C-位點1的曲面表示[6]圖4 R與β-LG的分子對接Fig.4 Molecular docking of rutin with β-LG

2.5.2 分子動態(molecular dynamics, MD)模擬

分子動態模擬[48]能在原子水平上獲取蛋白質的結構信息，且具有瞬時清晰度，能夠得到構象變化、配體結合以及蛋白質折疊的信息。此外，分子動態模擬還可在原子水平上預測干擾(突變、磷酸化、質子化或配體的添加或去除)對生物分子的影響。缺點是識別最相關、最重要的信息具有挑戰性，在模擬過程中共價鍵不會形成和斷裂，因此應小心設置[49]。AL-SHABIB等研究R與β-LG互作的動力學性質[6]，發現配體的均方根偏差(root mean square distance, RSMD)和旋轉半徑均表現為初始階段的數據波動，最后達到穩定。可能是由于R進入β-LG的疏水腔引起了相應的數據起伏，當穩定的復合物形成時,數據則達到穩定狀態。R與β-LG中的Glu62、Asp85和Asn90形成氫鍵，與Leu39、Val41和Ile84形成疏水相互作用。ZHANG等[50]研究7種黃酮類化合物(白楊素、山奈素、非瑟酮、高良姜素、染料木黃酮、槲皮素和芹菜素)與細胞周期蛋白依賴性激酶6/細胞周期D(CDK6/cyclin D)形成的復合物系統的穩定性時，發現前6種多酚的RSMD均小于0.35 nm，即適用于MD模擬分析，其中非瑟酮、槲皮素以及三奈素的RSMD(小于0.05 nm)波動均小于其他多酚。此外，芹菜素與蛋白形成的氫鍵數量高于其他多酚。3’,4’,7-三羥基黃酮(M15)與CDK6/cyclin D的MD模擬圖如圖5所示[50]。

圖5 (a)M15的化學結構；(b)M15-CDK6/cyclin D復合物的RMSD分布；(c)M15-CDK6/cyclin D相互作用圖；(d)MD模擬期間氫鍵的數目[50]Fig.5 (a)Chemical structure of M15; (b)RMSD profile of M15-CDK6/cyclin D complex; (c)M15-CDK6/cyclin D interaction plot;(d)The number of hydrogen bonds during the MD simulation

3 展望

由于多酚對人體健康具有良好的促進作用，且與蛋白質大分子具有高度親和力。深入研究多酚與蛋白質相互作用機制可以有助于改進富含蛋白質與酚類化合物的食品生產工藝條件和參數，提升產品的營養價值。鑒于目前研究多酚與蛋白質相互作用的技術手段各有優勢，因此需將多種表征方法綜合應用，例如，常采用熒光光譜法、紫外可見光譜和FT-IR等方法聯合表征多酚與蛋白質相互作用，獲得不同的物理化學參數，從不同角度解析多酚與蛋白質相互作用機制。與此同時，深入研究多酚與蛋白質相互作用還需要創新應用新的檢測方法與技術，如液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)，更好地獲得關于蛋白質與酚類化合物相互作用的詳細信息。隨著蛋白組學技術(蛋白質制備、分離、鑒定和相互作用等技術)的不斷完善，必定會頻繁地應用在多酚-蛋白質相互作用的研究中；同時，傳統蛋白質化學技術與光譜技術的聯合應用也具有較大的應用前景。