CRISPR/Cas9介導的低產尿素黃酒酵母工程菌的構建

謝文娟，吳殿輝，李曉敏，蔡國林，謝廣發，陸健*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 4(浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州，310015)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，又名尿烷(urethane)，不易揮發，溶于水和有機溶劑(乙醇、氯仿、乙醚、苯等)[1]。EC普遍存在于腐乳、醬油等發酵食品及清酒、黃酒、葡萄酒、威士忌、白蘭地等酒精飲料中[2-4]，被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為2A類致癌物質，而且限定了其使用范圍[5]。鑒于酒精飲品是人體攝入EC的主要來源，加拿大和捷克等國家紛紛對市場上各類酒精飲品中EC的含量規定了限量標準[6]。

黃酒中的EC主要是是由尿素和乙醇自發反應生成的，黃酒發酵液中尿素含量的多少直接影響EC含量的高低[7]。因而，降低發酵液中尿素的含量是減少黃酒中EC含量的首要途徑。黃酒中的尿素主要由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的精氨酸酶(由CAR1編碼)降解精氨酸生成。尿素既可以被脲基酰胺酶(由DUR1,2編碼)水解為NH3和CO2，也可以被分泌到胞外進入發酵醪液。在氮源不足的情況下，由DUR3基因編碼的轉運蛋白可以將發酵液中的尿素轉運至胞內，作為氮源供釀酒酵母生長和代謝所用。在降低發酵酒中尿素含量的探索中，更多的學者集中在對精氨酸酶、脲基酰胺酶以及尿素轉運蛋白的單一代謝改造研究，通過敲除CAR1[8-10]、過表達DUR1,2[11-12]或DUR3[13-14]等策略來降低發酵酒中尿素的含量。也有學者對其中的2個基因同時進行改造以降低發酵酒中尿素的含量[15]。分別改造CAR1、DUR1,2、DUR3基因或者雙重改造可以在一定程度上降低發酵酒中尿素和EC的含量，但是目前尚未見對3個基因同時進行代謝改造以降低發酵液中尿素含量的研究。

本研究將釀酒酵母PGK1(3-磷酸甘油酸激酶基因)的強啟動子(PGK1p)作為調控元件，組建DUR3過表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”，利用CRISPR/Cas9技術[16-17]轉化已經改造過CAR1和DUR1,2基因的單倍體菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1，通過同源重組在HO基因位點插入DUR3過表達組件，以期構建進一步降低發酵液中尿素含量的酵母工程菌，從而減少黃酒中EC的形成，提高黃酒的飲用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、pMGKR質粒(攜帶釀酒酵母PGK1的強啟動子PGK1p)由本實驗室保存。單倍體黃酒酵母S.cerevisiaeNa(MATa)和工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1(MATaura3car1::ura3 Φ(DUR1,2-URA3-PGK1p))由本實驗室分離和構建[18-19]。其中單倍體S.cerevisiaeNa是通過敲除二倍體黃酒酵母N85的HO基因分離獲得[18]，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1是通過敲除S.cerevisiaeNa菌株的CAR1基因和過表達DUR1,2基因獲得[19]。CRISPR/Cas9質粒含有核酸酶Cas9蛋白和G418抗性基因KanMX，購于Addgene公司。sgRNA轉錄表達框由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培養基

YPD培養基、LB培養基、G418篩選培養基(YPD加入350 μg/mL G418硫酸鹽)分別用于酵母菌的培養和保存、大腸桿菌的培養和保存、酵母轉化子的篩選。

1.1.3 酶和主要試劑

Prime STAR DNA polymerase、ExTaqDNA polymerase、rTaqDNA polymerase、T4 DNA Ligase、SphI、NotI、pMD19-T Vector：寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒，氨芐青霉素(Amp)，G418硫酸鹽：生工生物工程(上海)有限公司；引物合成及DNA片段測序均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.1.4 主要儀器

Powerpac Basic高電流電泳儀、Mastercycler pro PCR儀，德國Eppendorf公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達科技發展有限公司；Gene Pulser Xcell電擊轉化儀，美國Bio-Rad公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱，美國Agilent公司。

1.1.5 引物設計及合成

按照釀酒酵母S.cerevisiaeS288C的PGK1p、HO與DUR3基因的核苷酸序列，設計表1中的擴增引物。

表1 實驗中用到的引物Table 1 Primers used in the study

注：下劃線表示用于融合PCR的重疊序列；*表示加粗斜體為SphI酶切位點；#表示加粗斜體為NotI酶切位點

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒酵母DUR3基因過表達組件的構建

本研究基于融合PCR的原理，將釀酒酵母DUR3基因置于其自身的強啟動子PGK1p調控之下。DUR3基因過表達組件的構建如圖1所示。

圖1 DUR3基因過表達組件的組建示意圖Fig.1 Illustration of the construction of DUR3 over-expression cassette

首先，提取釀酒酵母S.cerevisiaeNa的基因組作為模板，分別以HO-L-1/HO-L-2，HO-R-1/HO-R-2，DUR3-1/DUR3-2為引物，擴增HO上游同源臂(HOL)、HO下游同源臂(HOR)和DUR3片段。以PGK1p-F/PGK1p-R，PGK1t-F/PGK1t-R為引物，pMGKR質粒為模板，PCR擴增獲得PGK1基因的啟動子PGK1p和終止子PGK1t。以HOL、HOR、PGK1p、DUR3、PGK1t為模板，HO-L-1/HO-R-2為引物，采用一種已報道的構建基因組件的高效方法[14]獲得DUR3過表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”。

1.2.2 CRISPR-DUR3質粒的構建

以HO-F/gRNA-R為引物，以HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR、sgRNA轉錄表達框為模板，采用一種已報道的構建基因組件的高效方法[18]，由融合PCR得到DUR3基因過表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR-sgRNA”。經瓊脂糖凝膠電泳驗證后進行T克隆，得到質粒pMD19-DUR3-sgRNA，并測序驗證其序列的正確性。

質粒CRISPR-Vector與pMD19-DUR3-sgRNA分別經SphI和NotI雙酶切(圖2)，瓊脂糖凝膠電泳后回收線性化的質粒CRISPR-Vector (13466 bp)和DUR3-sgRNA片段(4537 bp)，利用T4 DNA連接酶連接并轉化E.coliJM109構建CRISPR-DOR3質粒，挑取陽性克隆子提取質粒DNA，經PCR和酶切，送樣測序驗證。

圖2 CRISPR-DUR3質粒的構建Fig.2 Construction of CRISPR-DUR3

1.2.3 電轉化單倍體S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1以及轉化子的鑒定

將構建的質粒CRISPR-DUR3通過高效電轉化法轉化釀酒酵母S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1[20-22]，并涂布于G418篩選培養基，30 ℃培養至長出轉化子，以HO-L-1/HO-R-2為引物進行菌落PCR初步驗證，并提取陽性轉化子的基因組，以HO-L-1/HO-R-2為引物再次驗證，送樣測序驗證。

將陽性轉化子轉接到不含抗性的YPD液體培養基連續培養10代以上，丟失CRISPR-DUR3質粒，最終得到不含外源抗性基因的釀酒酵母工程菌。

1.2.4 工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1中DUR3基因轉錄水平驗證

1.2.5 實驗室規模黃酒釀造實驗

分別以出發菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1、親本菌株S.cerevisiaeNa及本研究構建的釀酒酵母工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1進行黃酒釀造實驗。黃酒發酵工藝流程按照文獻進行[24]。

1.2.6 黃酒發酵液指標測定

黃酒發酵液中氨基酸態氮、pH值、總酸、酒精度和總糖等指標的測定按照國標GB/T13662-2008黃酒的測定方法[25]。

1.2.7 黃酒發酵液中尿素含量的測定

采用高效液相色譜法，結合熒光檢測器測定黃酒發酵液中尿素的含量[26]。

1.2.8 黃酒發酵液中EC含量的測定

發酵液中EC含量的測定采用固相萃取-同位素稀釋法[2]。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母工程菌的構建與鑒定

2.1.1DUR3基因過表達組件及CRISPR-DUR3質粒的構建與鑒定

按照1.2.1中所述的融合PCR方法獲得DUR3基因過表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”。由圖3的瓊脂糖凝膠電泳結果表明，PCR擴增獲得的DUR3過表達組件大小為4 087 bp，與預期片段大小相符，并通過測序驗證了其序列的正確性。然后，按照1.2.2的方法，將含有DUR3基因過表達組件的T克隆質粒與CRISPR-Vector分別進行雙酶切，在DNA連接酶的作用下構建含有DUR3過表達組件和sgRNA片段的CRISPR-DUR3質粒，并通過測序驗證了其序列的正確性。

M-5kb Marker; 1- DUR3過表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的PCR產物圖3 DUR3基因過表達組件的PCR驗證Fig.3 The verification of DUR3 overexpression cassette by PCR

2.1.2 過表達DUR3基因的釀酒酵母工程菌的構建

因CRISPR-DUR3質粒帶有G418抗性，因此，CRISPR-DUR3質粒成功轉化S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1后獲得的釀酒酵母轉化子可以在G418篩選培養基上生長。提取陽性轉化子的基因組，用HO-L-1/HO-R-2作為引物進行PCR擴增驗證,如圖4所示。

M-5kb Marker；1-以S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1的基因組為模板的PCR產物；2-以S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1的基因組為模板的PCR產物圖4 酵母工程菌轉化子的PCR鑒定電泳圖Fig.4 Screening of transformations of overexpression cassette by PCR

陽性轉化子可以擴增出1條4 087 bp大小的片段，與基因表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的大小相符；而陰性對照則只能得到1049 bp大小的HO基因片段。回收和純化4 087 bp大小的片段后，經測序驗證了其序列的正確性。表明DUR3過表達組件在CRISPR/Cas9的作用下成功整合到S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1菌株的基因組。獲得的酵母工程菌命名為S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1。由圖5可知，將工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1在YPD培養基中連續傳代培養10代以后，工程菌不能在含有G418的平板上生長，說明CRISPR-DUR3質粒已丟失，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1不含外源抗性基因。

A-工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在YPD平板上的培養結果； B-工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在G418篩選培養基平板上的培養結果圖5 連續傳代培養10代后釀酒酵母工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在不同培養基平板上的培養結果Fig.5 The growth of modified strain S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1 on different medium plate after 10 generation of continuous culture

2.2 工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1中DUR3基因轉錄水平驗證結果

如圖6所示,DUR3基因過表達組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”在酵母基因組重組后，構建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1的DUR3基因表達水平提高，相較出發菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1，在12、24、36、48 h，DUR3基因的轉錄水平分別提高了2.1倍、3.7倍、2.3倍和2.2倍，說明強啟動子PGK1p的插入明顯提高了工程菌DUR3 基因的轉錄水平。

圖6 代謝改造對酵母DUR3基因表達量的影響Fig.6 Effects of metabolic engineering on the expression of DUR3

2.3 釀酒酵母工程菌發酵性能的驗證

將構建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1與親本菌株S.cerevisiaeNa及出發菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1分別進行實驗室三角瓶黃酒發酵實驗，考察工程菌在黃酒發酵過程中的生長和發酵性能。由CO2失重曲線(圖7)可知，工程菌與親本菌株和出發菌株的失重曲線一致，說明其發酵能力與親本菌株和出發菌株基本相同。

圖7 工程菌黃酒發酵過程中CO2失重曲線Fig.7 Loss weight of CO2during the fermentation of Chinese rice wine by engineered strain

由表2檢測結果可知，工程菌與親本菌株和出發菌株發酵液的總糖、總酸、氨基酸態氮和酒精含量以及pH值基本沒有差異，說明對出發菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1的DUR3基因進行代謝工程改造沒有影響其生長和發酵性能。

2.4 釀酒酵母工程菌降低發酵液中尿素和EC能力的考察

如表2所示，過表達DUR3基因的酵母工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1發酵液中尿素的含量為(3.0±0.4)mg/L，與親本菌株S.cerevisiaeNa(38.0±0.8) mg/L和出發菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1(5.3±0.5)mg/L相比，分別降低了92.1%和43.4%。

表2 黃酒發酵液中理化指標及尿素和EC含量的測定Table 2 Measurement of the concentrations of metabolites and urea and EC in Chinese rice wine samples by different strains

尿素是黃酒發酵液中EC形成的主要前體物質，因此工程菌發酵液中EC含量也顯著降低(表2)。與親本菌株和出發菌株相比，S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1發酵液中EC含量[(17.1±1.2)μg/L]分別降低了58.6%和16.2%。說明過表達DUR3基因的釀酒酵母工程菌可以在黃酒發酵過程中吸收醪液中的尿素，從而進一步降低了發酵液中尿素的含量，減少了EC的形成。

3 討論

釀酒酵母HO基因能夠使單倍體的接合型MATa和MATα發生轉變，然后與周圍的單倍體發生同宗融合形成二倍體，而該基因的表達對酵母自身的生長和代謝并無影響。本研究將構建的DUR3基因過表達組件通過同源重組整合在釀酒酵母基因組的HO位點，可以在不影響酵母生長和代謝的情況下實現DUR3基因的過表達。此外，借助CRISPR/Cas9基因組編輯系統和一段短的單鏈引導RNA (single guide RNA, sgRNA)對釀酒酵母特定的DNA序列進行識別并高效編輯，無外源基因殘留于酵母基因組上，具有生物安全性。

氨基甲酸乙酯(EC)是存在于黃酒中的潛在致癌物，主要由尿素和乙醇自發反應形成。所以降低發酵液中尿素的含量可以從根源上減少黃酒中EC的形成。黃酒中大部分的尿素是由釀酒酵母在發酵過程中代謝精氨酸產生，而釀造原料也會帶入少量尿素。因此，本研究以前期構建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1為出發菌株，在敲除CAR1和過表達DUR1,2基因的基礎上過表達DUR3基因，成功構建具有“尿素吸收”功能的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1。實驗結果表明，與出發菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1相比，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1的DUR3基因表達量顯著提高，而且黃酒發酵液中尿素和EC的含量分別降低了43.4%和16.2%。說明在黃酒發酵過程中，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1在不影響釀酒酵母生長和發酵性能的前提下，不但可以減少釀酒酵母代謝產生的尿素，還可以將發酵醪液中由原料帶入的尿素轉運至酵母胞內，從而進一步降低發酵液中尿素的含量，減少EC的形成，具有工業化應用的潛在可能性。