黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化

高慶超，常應(yīng)九，馬蓉，曹效海, 2，王樹(shù)林, 2*

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016) 2(青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧，810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)屬于茄科枸杞屬，主要分布于我國(guó)西北等地，其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分，且具有多種生物活性，如抗氧化、抗疲勞、預(yù)防癌癥、抗心血管疾病等[1-2]，充分利用黑果枸杞及其藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)新的食品及藥品，對(duì)人類(lèi)健康具有重要意義。

酵素是以乳酸菌、酵母菌等多菌種復(fù)合發(fā)酵果蔬、菌菇及中草藥等，形成富含礦物質(zhì)、維生素、多種酶、有機(jī)酸和少量乙醇等產(chǎn)物的液態(tài)或固態(tài)食品[3]。酵素舊稱(chēng)為“酶”，但不只是酶，它還包含產(chǎn)酶微生物和相互調(diào)節(jié)因子及其相互作用的產(chǎn)物，強(qiáng)調(diào)的是微生態(tài)整體[4-5]。酵素中主要微生物為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，其發(fā)酵過(guò)程是復(fù)雜的間歇性過(guò)程[6]，TEOH等[7]從紅茶菌酵素分離出接合酵母。盧夢(mèng)瑤等[8]以10種酵素為菌源，經(jīng)分離純化、產(chǎn)酸定性和定量試驗(yàn)及16S rDNA水平鑒定，獲得1株高產(chǎn)醋酸菌為芝庇儂醋酸桿菌。MARISA等[9]從諾麗酵素中分離出歐文氏菌和葡萄糖桿菌。

傳統(tǒng)微生物分離方法是在微生物發(fā)酵食品領(lǐng)域中一種最常用的研究方法，但其得到的微生物信息較片面，有很大的局限性，而近年來(lái)，由于高通量測(cè)序技術(shù)具備靈敏度高、讀數(shù)長(zhǎng)和效率高的特點(diǎn)，能更加真實(shí)地反映發(fā)酵食品中微生物群落定性及相對(duì)定量的遺傳信息[10-11]，已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物體系研究。

本研究以黑果枸杞酵素為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵階段的酵素中的主要微生物群落構(gòu)成及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，為揭示黑果枸杞酵素發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)變化和相互作用關(guān)系提供依據(jù)，以期能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群的調(diào)控，為黑果枸杞酵素的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料及儀器

黑果枸杞、枸杞、瑪卡、蕨麻、沙棘粉等，青海千平萬(wàn)安農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA)；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒(Life)；2×TaqMaster Mix(Vazyme)；MagicPure Size Selection DNA Beads(Transgen)等。

Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP；Qubit?3.0熒光計(jì)，Invitrogen；PCR儀，BIO-RAD；DYCP-31DN DNA電泳槽，北京六一儀器廠(chǎng)；混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑果枸杞酵素制作

稱(chēng)取黑果枸杞300 g、枸杞200 g、蕨麻125 g、瑪卡75 g、紅糖125 g、沙棘粉25 g、無(wú)菌水2 L，瑪卡和蕨麻清洗后水煮60 min至變軟，黑果枸杞和枸杞清洗后按質(zhì)量比1∶3加無(wú)菌水進(jìn)行復(fù)水，將全部原料打漿，轉(zhuǎn)至滅菌壇中攪勻，密封并做相應(yīng)標(biāo)記，置于28 ℃培養(yǎng)箱下避光發(fā)酵，每10 d平行取樣3次，并編號(hào)為0、10、20、30、40、50和60 d，置于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2.2 理化及活性成分的測(cè)定

可滴定酸按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[12]。總糖含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[13]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=7.235 6x-0.012(R2=0.990 6)。花青素含量測(cè)定采用pH示差法[14]。總酚含量測(cè)定采用福林酚法[15]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.101 4x+0.044 4(R2=0.999 4)。SOD酶活力按照SOD試劑盒中的方法進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)委托青海譜測(cè)檢測(cè)有限公司對(duì)黑果枸杞酵素中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 高通量測(cè)序

將第0、10、20、30、40、50和60天取的樣品委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、凝膠電泳、上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類(lèi)后，根據(jù)97%相似性將序列分成不同的操作單元(operational taxonomic units, OTU)，并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3.1 DNA提取

分別取第0、10、20、30、40、50、60天樣品，采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA和真菌基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增

以341F(5’- CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)/805(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)序列；以ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)/ITS2R(5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)為引物擴(kuò)增真菌ITS rDNA ITS1-2區(qū)序列。第一輪擴(kuò)增：擴(kuò)增體系： 2×Taqmaster Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，加H2O 30 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5 個(gè)循環(huán)，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸5 min，10 ℃保存。第二輪擴(kuò)增：引入Illumina橋式PCR兼容引物，擴(kuò)增體系： 2×Taqmaster Mix 15 μL，Primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，PCR產(chǎn)物(上一輪) 20 ng，加H2O 30 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸5 min，10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的條帶，并對(duì)DNA進(jìn)行純化回收。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2007、R軟件、SPSS Statistics 20.0等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞酵素中理化及活性成分測(cè)定結(jié)果

發(fā)酵前后黑果枸杞酵素中理化及活性成分測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 黑果枸杞酵素發(fā)酵前后理化及活性成分含量變化Table 1 The changes of physicochemical and active ingredient contents of enzymes includingLycium Ruthenicum Murr. before and after fermentation

注：“-”表示未測(cè)。

由表1可以看出，黑果枸杞在60 d時(shí)，相關(guān)理化及活性成分發(fā)生了變化，可滴定酸含量增加了290.81%，總糖含量降低了62.91%，總酚含量增加了80.42%，SOD酶活力上升了5.90%。花青素保留率為42.49%，由于酵素中酸含量上升，花青素在酸性條件下會(huì)在一定程度上延緩花青素的降解且致病菌(大腸桿菌和沙門(mén)氏菌)未超標(biāo)。從這些指標(biāo)中可以看出，黑果枸杞酵素在發(fā)酵60 d后，除花青素有所損失，其他指標(biāo)都呈現(xiàn)較好的水平，因此，可以判定黑果枸杞酵素在發(fā)酵60 d后擁有較高的質(zhì)量水平。

2.2 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的Alpha多樣性分析

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示樣品中微生物的多樣性，Shannon值越大，Simpson值越小，說(shuō)明群落多樣性越高；ACE指數(shù)和Chao指數(shù)是用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，即群落的豐富度；Coverage指數(shù)表示各樣本文庫(kù)的覆蓋率[16]。

2.2.1 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析

對(duì)不同發(fā)酵階段的黑果枸杞酵素的細(xì)菌群落進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of bacterial community during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr.

由表2可知， 0、10、20 d樣品中細(xì)菌群落的多樣性相對(duì)較高，30、40 d樣品中細(xì)菌群落的多樣性相對(duì)較低；0、20 d樣品中細(xì)菌群落的豐富度相對(duì)較高，40、50 d樣品中細(xì)菌群落的豐富度相對(duì)較低。結(jié)果表明，黑果枸杞酵素在發(fā)酵0～20 d中細(xì)菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高。

2.2.2 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中真菌群落的Alpha多樣性分析

對(duì)不同發(fā)酵階段的黑果枸杞酵素的真菌群落進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中真菌群落的Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of fungal community during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr.

由表3可知，30、40、50 d樣品中真菌群落的多樣性相對(duì)較高，0、60 d樣品中真菌群落的多樣性相對(duì)較低；30、40、50 d樣品中真菌群落的豐富度相對(duì)較高，10、20 d樣品中真菌群落的豐富度相對(duì)較低；結(jié)果表明黑果枸杞酵素在發(fā)酵30～50 d中真菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高。

2.3 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.3.1 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

對(duì)不同發(fā)酵階段黑果枸杞酵素中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行門(mén)和屬水平上的分析，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌門(mén)水平分布圖Fig.1 The histogram of bacteria during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in phylum

由圖1可知，在門(mén)水平上，共檢測(cè)出26種已知的細(xì)菌門(mén)，其中，0 d樣品中主要為變形菌門(mén)(Proteobacteria)，所占比例約為99%。在10、20、30、40、50、60 d樣品中主要為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，所占比例96.9%～99.1%。

圖2 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌屬水平分布圖Fig.2 The histogram of bacteria during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in genus

由圖2可知，在屬水平上，共檢測(cè)出48種已知的細(xì)菌屬。在0 d樣品中主要為泛菌屬(Pantoea)71.35%、假單胞菌屬(Pseudomonas)14%、歐文氏菌屬(Erwinia)6.61%。在10 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)57.92%、乳球菌屬(Lactococcus)14.23%、魏斯氏菌屬(Weissella)12.08%、腸球菌屬(Enterococcus)9.45%、片球菌屬(Pediococcus)4.41%。在20 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)77.28%、腸球菌屬(Enterococcus)19.39%。在30 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)96.26%、腸球菌屬(Enterococcus)2.78%。在40 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)96.8%、腸球菌屬(Enterococcus)2.18%。在50 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)96.8%、腸球菌屬(Enterococcus)2.18%。在60 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)95.1%、乳球菌屬(Lactococcus)1.82%、片球菌屬(Pediococcus)1.77%。以上結(jié)果說(shuō)明未經(jīng)發(fā)酵的原料汁中細(xì)菌主要為泛菌屬(Pantoea)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，在發(fā)酵第10 天時(shí)，酵素中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和腸球菌屬(Enterococcus)含量增加，在發(fā)酵第20天時(shí)，酵素中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)含量增加，說(shuō)明在發(fā)酵0～20 d時(shí)，酵素中細(xì)菌群落的豐富度與多樣性相對(duì)較高，這也與Alpha多樣性指數(shù)分析中結(jié)果一致。在發(fā)酵第30、40、50、60天時(shí)，酵素中細(xì)菌種類(lèi)趨于穩(wěn)定，主要優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。

2.3.2 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

對(duì)不同發(fā)酵階段黑果枸杞酵素中真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行門(mén)和屬水平上的分析，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

由圖3可知，在門(mén)水平上，共檢測(cè)出11種已知的真菌門(mén)，且相比于酵素中的細(xì)菌變化趨于穩(wěn)定，真菌變化更為復(fù)雜。在0 d樣品中真菌主要為子囊菌門(mén)(Ascomycota)49.75%，擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)3.86%，無(wú)法歸類(lèi)的菌類(lèi)占45.99%，說(shuō)明在未經(jīng)發(fā)酵前，原料中菌類(lèi)非常復(fù)雜。在10 d樣品中真菌主要為子囊菌門(mén)(Ascomycota)67.68%，擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)18.16%，無(wú)法分類(lèi)的菌類(lèi)占12.54%；在20 d樣品中真菌主要為子囊菌門(mén)(Ascomycota)84.22%，擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)14.34%；在30 d樣品中真菌主要為子囊菌門(mén)(Ascomycota)57.61%，擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)38.04%；在40 d樣品中真菌主要為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)56.1%，子囊菌門(mén)(Ascomycota)32.53%，無(wú)法歸類(lèi)的真菌5.35%；在50 d樣品中真菌主要為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)39.37%，子囊菌門(mén)(Ascomycota)37.03%，被孢霉菌門(mén)(Mortierellomycota)3.22%，無(wú)法歸類(lèi)的真菌10.83%，無(wú)法分類(lèi)的菌類(lèi)占8.84%；在60 d樣品中真菌主要為子囊菌門(mén)(Ascomycota)93.73%，擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)4.85%。

圖3 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中真菌門(mén)水平分布圖Fig.3 The histogram of fungi during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in phylum

圖4 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中真菌屬水平分布圖Fig.4 The histogram of fungi during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in genus

由圖4可知，在屬水平上，共檢測(cè)出32種已知的真菌屬。在0 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)25.52%，鐮刀菌屬(Fusarium)9.25%，球腔菌屬(Mycosphaerella)6.62%，枝孢霉屬(Cladosporium)3.02%，無(wú)法歸類(lèi)的菌類(lèi)占45.99%；在10 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)18.84%，曲霉菌屬(Aspergillus)16.33%，黑粉菌屬(Filobasidium)11.44%，球腔菌屬(Mycosphaerella)8.53%，青霉菌屬(Penicillium)7.21%，鐮刀菌屬(Fusarium)3.7%，無(wú)法分類(lèi)的菌類(lèi)占12.54%；在20 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)38.97%，球腔菌屬(Mycosphaerella)20.58%，枝孢霉屬(Cladosporium)10.74%，F(xiàn)ilobasidium8.87%，鐮刀菌屬(Fusarium)5.36%；在30 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)17.6%，F(xiàn)ilobasidium16.3%，Membranomyces11.17%，球腔菌屬(Mycosphaerella)10.32%，枝孢霉屬(Cladosporium)5.96%，青霉菌屬(Penicillium)5.77%，鐮刀菌屬(Fusarium)5.51%；在40 d樣品中真菌主要為鎖瑚菌屬(Membranomyces)34.42%，黑粉菌屬(Filobasidium)7.82%，絲蓋傘屬(Inocybe)6.12%，鏈格孢屬(Alternaria)6.07%，球腔菌屬(Mycosphaerella)4.3%，鐮刀菌屬(Fusarium)3.4%，枝孢霉屬(Cladosporium)2.76%；在50 d樣品中真菌主要為Membranomyces23.59%，Inocybe5.86%，擬青霉屬(Simplicillium)3.82%，被孢霉屬(Mortierella)3.22%，鐮刀菌屬(Fusarium)2.59%，青霉菌屬(Penicillium)1.93%，無(wú)法歸類(lèi)的真菌10.83%，無(wú)法分類(lèi)的菌類(lèi)占8.84%；在60 d樣品中真菌主要為酵母屬(Saccharomyces)89.83%，黑粉菌屬(Filobasidium)1.79%，鎖瑚菌屬(Membranomyces)1.61%，球腔菌屬(Mycosphaerella)1.11%。在發(fā)酵過(guò)程中其主要作用的是鏈格孢屬(Alternaria)、球腔菌屬(Mycosphaerella)、黑粉菌屬(Filobasidium)、鎖瑚菌屬(Membranomyces)、酵母屬(Saccharomyces)等，在發(fā)酵60 d后，主要真菌為酵母屬(Saccharomyces)，且經(jīng)分析主要為啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

2.4 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落豐度熱圖分析

采用群落Heatmap圖分析微生物物種和不同發(fā)酵階段樣品之間的交互關(guān)系，見(jiàn)圖5和圖6。

由圖5可知，在細(xì)菌屬水平上，30 d和40 d樣品最為相似，0 d樣品與10、20、30、40、50、60 d樣品細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異明顯，在0 d樣品中，泛菌屬(Pantoea)為優(yōu)勢(shì)菌屬；在10、20、30、40、50、60 d樣品中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為優(yōu)勢(shì)菌屬。

由圖6可知，在真菌屬水平上，10、20與30 d樣品較相似，40與50 d樣品較相似，60 d樣品與其他樣品組之間真菌結(jié)構(gòu)差異明顯。在0 d樣品中，無(wú)法歸類(lèi)的菌類(lèi)較多，真菌的種類(lèi)較復(fù)雜，其次為鏈格孢屬(Alternaria)；在10、20與30 d樣品中，主要為鏈格孢屬(Alternaria)，球腔菌屬(Mycosphaerella)，F(xiàn)ilobasidium，枝孢霉屬(Cladosporium)，青霉菌屬(Penicillium)，說(shuō)明在發(fā)酵第10～30天，這幾類(lèi)真菌起主要作用，且動(dòng)態(tài)變化此消彼長(zhǎng)。在40 d與50 d樣品中，真菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高，鎖瑚菌屬(Membranomyces)為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬。在60 d樣品中，真菌群落多樣性和豐富度最低，酵母屬(Saccharomyces)為優(yōu)勢(shì)真菌屬。

圖5 細(xì)菌屬水平豐度熱圖Fig.5 The heatmap of bacteria in genus

2.5 黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的主成分分析

對(duì)不同發(fā)酵階段的黑果枸杞酵素中細(xì)菌和真菌在屬水平上進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

由圖7可知，主成分1表示所有變量的88 %，主成分2表示所有變量的10%，總計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)98 %。從PCA2方向看，0 d樣品與10、20、30、40、50、60 d樣品差異明顯，從PCA1方向看，0，10，20 d與30、40、50、60 d樣品差異明顯，說(shuō)明PCA1是導(dǎo)致樣本間差異的主要因素。30、40、50、60 d樣品在PCA1與PCA2方向距離較近，相對(duì)聚集，說(shuō)明此發(fā)酵階段，樣品最為相似。

圖6 真菌屬水平豐度熱圖Fig.6 The heatmap of fungi in genus

圖7 細(xì)菌屬水平主成分分析Fig.7 The principal component analysis of bacteria in genus

圖8 真菌屬水平主成分分析Fig.8 The principal component analysis of fungi in genus

由圖8可知，主成分1表示所有變量的46%，主成分2表示所有變量的31%，總計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)77%。從PCA1方向看，0 d樣品與10、20、30、40、50、60 d樣品差異明顯，從PCA2方向看，各樣品間距離分布差異明顯，說(shuō)明PCA2是導(dǎo)致樣本間差異的主要因素。

3 討論

有研究表明，在酵素中主要微生物為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，但有些酵素由于原料不同，可能不會(huì)有醋酸菌的大量生長(zhǎng)繁殖[17-18]。通過(guò)高通量測(cè)序分析黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化，樣品中未檢測(cè)到醋酸菌，而是酵母菌、乳酸菌和霉菌在發(fā)酵期間起主要作用，這也與OKADA等[19]研究結(jié)果一致。

由圖2和圖5可知，在未發(fā)酵前主要為泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)，但在發(fā)酵后，這3種菌屬含量急劇減少，可能與發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸、碳源和氮源消耗較快、pH變化等有關(guān)[20]。在發(fā)酵中后期，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)起主要作用，成為優(yōu)勢(shì)菌屬，且腸球菌屬(Enterococcus)也占有一定比例，可能與其耐酸性強(qiáng)和發(fā)酵碳水化合物廣泛等有關(guān)，也有可能是由于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)具有的胞外多糖和分泌的細(xì)菌素保護(hù)了自身生長(zhǎng)繁殖，抑制或破壞了雜菌生長(zhǎng)[21]。

由表3和圖4可知，真菌動(dòng)態(tài)變化在酵素發(fā)酵過(guò)程中更為復(fù)雜，在發(fā)酵30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高。發(fā)酵前期和中期真菌多樣性和豐富度相對(duì)較高，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物增多，微生物之間競(jìng)爭(zhēng)愈發(fā)激烈，一些在酵素體系中適應(yīng)能力相對(duì)較弱的真菌被淘汰[22]，適應(yīng)能力強(qiáng)的真菌在后期發(fā)揮主要作用，在發(fā)酵60 d后，主要優(yōu)勢(shì)真菌屬為酵母屬(Saccharomyces)，且經(jīng)分析主要為啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

由于酵素近年來(lái)的火熱程度，目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于酵素中代謝產(chǎn)物的變化分析相對(duì)較多[23-25]，而關(guān)于采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酵素發(fā)酵過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行的研究報(bào)道相對(duì)較少。基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵階段的黑果枸杞酵素微生物的群落組成及多樣性進(jìn)行分析，將為今后黑果枸杞酵素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中菌種的調(diào)控提供理論依據(jù)，具有重大意義。

4 結(jié)論

黑果枸杞酵素在發(fā)酵0～20 d細(xì)菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高，在發(fā)酵30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高。在未發(fā)酵前，主要細(xì)菌為泛菌屬(Pantoea)，而真菌的種類(lèi)較為復(fù)雜，無(wú)法歸類(lèi)的真菌較多，已知真菌中鏈格孢屬(Alternaria)占比較大。在自然發(fā)酵過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，主要優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)。在發(fā)酵60 d后，主要細(xì)菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，主要真菌為酵母屬(Saccharomyces)。研究成果揭示了黑果枸杞酵素發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，為發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群的調(diào)控提供了方向，以期能開(kāi)發(fā)出高附加值的黑果枸杞功能性食品。