九種益生菌之間的相互作用及協同共生機理

劉學云，于新，何嘉敏，郭靖，王萍，王仲芬

(仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510000)

益生菌是指一類可通過改善腸道菌群平衡而對人的健康產生有利影響的活性微生物添加劑，已被廣泛應用于食品生產中[1-2]。諾貝爾獎的獲得者ELIE METCHNIKOFF認為，保加利亞人之所以長壽，是因為他們長期飲用發酵乳制品，其中的乳酸桿菌能改善人的腸道菌群平衡，從而降低產毒菌的活性[3]。經研究發現[4]，益生菌的活性在改善人體腸道內的菌群平衡中發揮決定性作用，要獲得較好的治療效果，益生菌必需達到一定的數量。但是，由于益生菌的活菌期時間短[5]，在加工和貯藏過程中保證生物活性是其產品面臨的巨大挑戰[6]。

目前，為了解決上述問題，提高生產效率與產品質量，開發出一種新的綠色無污染生產發酵模式——混合發酵[7-8]。利用菌種之間的優勢互補，一株菌的代謝物可能刺激另一株菌生長代謝，從而產生單菌發酵無法獲得的產物及高活菌數。但是，菌種之間是否會產生拮抗作用、引起拮抗作用的原因，以及哪些菌種之間有協同作用是需要關注的問題。鑒于此，本文研究的重點就是雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬的9種常用的益生菌間的相互作用，對菌種之間的協同作用機理進行初步的探討，為益生菌混合發酵、微生物制劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbruechiisubsp.Bulgaricus，Ld)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，Lpl)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，St)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，Lr)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，La)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis，Bl)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum，Bb)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，Lc)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，Lpa)，丹尼斯克(中國)有限公司。

1.1.2 試劑與設備

TU-1901型雙光束紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；5810R型高速冷凍離心機，廣州卓越貿易有限公司；2.5 L三菱厭氧產氣袋，廣州卓森科學器材有限公司；0.22 μm水系濾膜，Millipore公司。

1.1.3 試劑及培養基的配制

(1)MRS培養基

葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取粉5 g，檸檬酸二銨2 g，K2HPO42 g，乙酸鈉5 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，吐溫-80 1.0 mL，瓊脂15 g蒸餾水1 000 mL，用1.0 mol/mL的NaOH調pH 6.2～6.4。

(2)菌液的制備

益生菌接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，用0.9%無菌生理鹽水梯度稀釋后即為菌液。

(3)無細胞上清液的制備(cell-free supernatant，CFS)

益生菌接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h后，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后即為無細胞上清液[9]。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將冷凍保藏的菌種用接種環挑取一環接種于MRS固體培養基上劃線，37 ℃培養24 h左右，直至出現明顯的菌落，如此反復2次之后，挑取1環單菌落接種于MRS液體培養基中于 37 ℃培養24 h[10]。

1.2.2 活菌數的測定

采用平板菌落計數法[11]。

1.2.3 菌體濃度的測定

以未接種的MRS液體培養基為空白，取其菌液于600 nm的波長下，用紫外分光光度計測定菌液的OD600nm。

1.2.4 菌種間拮抗作用實驗

采用牛津杯擴散法[12]。

1.2.5 拮抗作用驗證實驗

將益生菌之間抑菌圈直徑10 mm實驗組進行驗證：指示菌液和拮抗菌無細胞上清液(CFS)按照1∶9的比例混合，以指示菌液+含1 g/L蛋白胨的0.9%無菌生理鹽水作為陽性對照，以0.9%無菌生理鹽水+拮抗菌CFS作為陰性對照。在37 ℃培養條件下分別于0、1.5、3、6、12、24 h取5 mL測定OD600nm。

1.2.6 菌種間協同作用實驗

將活化好的菌種按1%接種量接于MRS液體培養基中進行單獨培養；同時在相同的接種量情況下，按1∶1比例把無拮抗作用的菌種兩兩組合進行混合發酵，以不接菌的培養基為空白對照，37 ℃培養24 h，每2 h取樣測定菌液OD600 nm值，并繪制出生長曲線圖[13],以觀察乳酸菌單獨培養及混合發酵的生長變化，判斷是否存在協同作用。

1.2.7 協同作用生物驗證實驗

將具有協同作用的一種菌的CFS與MRS液體培養基混合，按照1∶1的比例接入待檢菌；再將一種菌進行高壓滅菌熱處理后，按1∶1的比例接入待測菌，37 ℃培養24 h，測其活菌數，比較單獨培養與上述培養方式的活菌數。

2 結果與分析

2.1 菌種間拮抗實驗

采用牛津杯擴散法對這9株益生菌進行體外拮抗實驗，如表1所示。

表1 益生菌間的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effects between probiotics

注：“×”代表未進行實驗；“—”代表無拮抗作用；抑菌圈數據為重復3次平均值±標準差。

約1/3的益生菌之間有一定的拮抗作用，其中Ld對Lpl、La有抑制作用，但對Bl、Lr、Bb、Lc、Lpa和St無拮抗作用；Lpl對Ld、Lr、Lc有抑制作用，但對Bl、La、Bb、Lpa和St無拮抗作用；Bl對Lr、La有抑制作用，對Lpa有明顯的抑制作用，但對Ld、Lpl、Bb、Lc和St無拮抗作用；Lr對La有抑制作用，對St的抑制作用顯著，但對Ld、Lpl、Bl、Bb、Lc和Lpa無拮抗作用；La對Ld有抑制作用，對Lpl、Bl、Lpa有一定的抑制作用但不顯著，對Lr、Bb、Lc和St無拮抗作用；Bb對Lpl、Lr、La有抑制作用，對St拮抗作用最為明顯，抑菌圈高達19.3 mm，但對Ld、Bl、Lc和Lpa無拮抗作用；Lc對Lpl有抑制作用，對Ld的抑制作用顯著，但對其余6株菌之間無拮抗作用；Lpa對Lpl的抑制作用明顯，對La的有一定的抑制作用但不顯著，但對Ld、Bl、Lr、Bb、Lc和St無拮抗作用；St對Lpa的抑制作用不顯著，對其余7株菌的生長繁殖均無抑制作用。而引起益生菌之間產生拮抗作用的原因，除發酵培養最終代謝物的乳酸以外，還產生H2O2[14]、乙醇、細菌素[15]、羅伊氏素[16]、乙酸和雙乙酰[17]等抑菌代謝物。

2.2 拮抗作用的驗證實驗

由表2可知，陰性對照組、陽性對照組和拮抗實驗組在0～3 h均無明顯增長，說明0～3 h為延滯期即開始緩慢生長，但從3 h后陽性對照組呈指數增長趨勢，此時菌液中的代謝產物迅速積累，菌液也開始變渾濁，OD600nm值顯著上升，而陰性對照組與拮抗實驗組均無明顯變化，這說明La的代謝產物對Lpl、Bl、Lpa有抑制作用，Lpa的代謝產物對La也有抑制作用；St的代謝產物產物對Bb有抑制作用。

表2 拮抗菌對指示菌的拮抗作用Table 2 Antagonistic effect of antagonistic bacteria on the indicator bacterium

注：表中數據為含10%指示菌的拮抗菌無細胞上清液在不同時間下600 nm波長的吸光值。

2.3 菌種協同作用實驗

由圖1可知，在0～4 h為延滯遲緩期即開始緩慢生長；4 h后進入對數增長期，此時菌液中的乳酸、蘋果酸、檸檬酸等[18]有機酸，迅速累積導致其pH值隨之降低，溶液中的其他代謝產物也隨之積累，此時菌液也開始出現渾濁；到10 h左右益生菌進入生長穩定期，此時菌株增長緩慢趨于平緩；再經過約18 h后進入生長衰退期，此時由于代謝產物增多，培養基營養物質減少，pH迅速下降，菌的生長受到抑制，并開始出現“自溶”[19]現象，大量菌體死亡。同時比較這9株益生菌在單獨純培養與兩兩組合共培養時菌液的OD600nm值變化發現，St分別與La、Ld、Lc共培養，Lc與La共培養在生長過程中所測得OD600nm值均明顯高于單菌純培養，從而推出Ld與St、St與La、St與Lc、Lc與La存在協同互生的關系，其余的菌種則是存在種間共存的關系。

圖1 益生菌單菌培養及兩兩組合共培養的生長曲線Fig.1 The growth curve of probiotic single bacteria culture and two-two combination co-culture

2.4 協同作用的驗證實驗

如圖2所示，加入StCFS可使La、Ld、Lc的活菌數較單菌培養明顯升高，同理,另一種菌CFS也可使具有協同作用的菌種活菌數較單菌培養顯著增加。因此，上述實驗結論與本實驗一致，即St與Ld、St與La、La與Lc、St和Lc具有協同作用。還發現高壓滅菌較過濾除菌的無細胞上清液活菌總數均小，這表明具有協同作用的代謝產物部分被熱破壞，菌種之間的協同作用與代謝產物有關。如保加利亞乳桿菌因不含有葉酸[20]、丙酮酸而缺少了生長所需的嘌呤[21]和甲酸，但St在發酵過程中產生的甲酸和丙酮酸會刺激保加利亞乳桿菌生長；而保加利亞乳桿菌產生的多肽和氨基酸類也可以促進St的生長代謝。

3 討論

通過對9種益生菌之間相互作用的研究，約1/3的益生菌之間都存在著拮抗作用，但Ld與St、St與La、St與Lc、Lc與La存在協同互生作用，且代謝產物與菌種間的協同作用有極大的關系。出現這種結果，可以從3個方面進行解釋：(1)微生態環境：益生菌的生長受生存環境的酸度、溫度影響，不同益生菌的產酸能力、耐酸能力及最適生長溫度等構成的復雜生態關系，同時也是制約混合培養過程中各益生菌生長的重要因素；(2)營養物質：益生菌生長需要大量的營養物質，菌種之間存在營養物競爭的關系；(3) 生理生化代謝：益生菌生長繁殖過程中可產生不同的代謝物，當一種菌產生的代謝物可以被另一種菌利用刺激其生長，即為協同作用，反之，如產生細菌素、H2O2、羅伊氏素(reuteri)等抑菌物質，對另一種菌產生抑制甚至是毒害作用。

圖2 益生菌之間的相互促進作用Fig.2 The mutual promoting effect between Lactic acid bacteria

SKRIVER等[22]提出將不同的益生菌進行組合可以發揮其不同的發酵性能；Lc和St混合發酵能明顯增加乳品的黏性和活菌數[23- 24]；舒國偉等發現Lc和St混合發酵對產酸速率、活菌數及酸羊乳的口感皆有較顯著的影響[25]；St刺激保加利亞乳桿菌生長的代謝產物是甲酸、丙酮酸和葉酸[26]。這些益生菌間的協同作用與本文研究結論一致，這可能是因為乳桿菌有較強的分解蛋白質的能力，能產生多種氨基酸，為St提供營養物質；同時由于桿菌產酸速率較慢，而St分解大分子的蛋白質較弱，但可以通過丙酮酸等快速代謝產生乳酸、甲酸、CO2等，這些有機酸是桿菌的生長刺激物，促進乳桿菌的生長。

本研究為益生菌發酵食品及微生物制劑的工業化應用和產業化生產提供了技術指導；為研究菌種間相互作用及益生菌菌劑組分提供理論基礎。而隨著益生菌被廣泛的應用，相互作用研究得不斷深入，發酵技術的不斷革新，必將推動整個益生菌行業發展進程。但從當前的研究報道來看，微生物混合發酵研究更多地局限于工藝的優化，而對菌種與菌種之間的拮抗和協同作用機理研究較少，對于具有協同關系菌株的篩選缺乏有效的方法與理論指導。因此，多菌種培養過程中菌種間的作用機理、具體的代謝產物、如何降低拮抗作用也是今后研究工作的重點和難點。