高分辨四極桿飛行時間質譜儀判別復原乳和超高溫滅菌乳

崔 婧，蘇美丞，譚冬飛，張 霞，賈 曼

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

牛乳因其獨特的口感和豐富的營養價值深受消費者喜愛。目前市場上出售的液態牛乳主要有巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳，但是，隨著牛乳消費量的增加，原料乳供不應求，加之乳粉價格低廉、易于運輸的優勢，有些不法廠商用乳粉勾兌制成復原乳，冒充超高溫滅菌乳而不加標識，極大地損害了消費者的合法權益。另一方面，由于乳粉加熱殺菌溫度高于超高溫滅菌乳，且與超高溫滅菌乳相比增加了噴霧干燥這一工藝過程，因此乳粉中的營養物質損失較為嚴重[1-2]。由于復原乳和超高溫滅菌乳的化學成分基本相同，因此判別復原乳和超高溫滅菌乳顯得尤為困難。為了保障消費者的合法權益，保障牛乳質量，尋找合適的區分復原乳和超高溫滅菌乳的方法至關重要。

目前判別復原乳的指標主要集中于糠氨酸[3]、乳果糖[4-6]、羥甲基糠醛、熱變性蛋白[7]等美拉德反應產物，相關的檢測技術主要有高效液相色譜法[3,8]、離子色譜法[9]、酶比色法[10-11]等。農業農村部新修訂的行業標準NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》[12]利用高效液相色譜法和分光光度法，選取糠氨酸和乳果糖作為復原乳的標示物，通過計算乳果糖和糠氨酸的比值來判別超高溫滅菌乳和復原乳，該標準的檢測方法耗時長、前處理復雜、靈敏度低。Marconi等[13]利用酶比色法測定巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中乳果糖含量，檢測靈敏度較高。但由于糠氨酸、乳果糖含量不僅受加熱溫度影響，而且還受到貯藏時間的影響[4,14-15]，因此，僅靠糠氨酸、乳果糖2 個指標判別超高溫滅菌乳和復原乳往往容易造成誤判。在這種情況下，尋找快速、準確判別超高溫滅菌乳和復原乳的方法顯得尤為重要。

高分辨四極桿飛行時間質譜儀由于具有高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的痕量物質，因此被廣泛應用于代謝組學分析[16-18]。化學計量學方法與代謝組學分析結合是目前最為先進的分析技術[19]。Mais等[20]利用超高效液相色譜-四極桿/飛行時間-質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS），采用非靶向代謝組學的方法，建立正交偏最小二乘方差判別分析模型來區分不同地理來源的生姜。Zhao Qiqi等[21]利用高分辨質譜儀結合化學計量學方法，監測到高血脂患者37 種血清代謝物的改變及參與的11 個途徑，為高血脂的早期風險評估提供了潛在的生物標志物，并為高血脂患者體內復雜的代謝途徑變化提供了進一步的見解。

本研究利用高分辨四極桿飛行時間質譜儀，采用非靶向代謝組學方法，結合化學計量學方法，找到14 種區別超高溫滅菌乳和復原乳的差異物質，并建立了區別2 種乳的判別模型，以期通過篩選出的14 種物質建立的判別模型能夠快速、準確地判別超高溫滅菌乳和復原乳，為復原乳的判別提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種不同品牌超高溫滅菌乳購自北京各大超市，10 種不同全脂基粉采自北京、內蒙古、河北和新西蘭。

乙腈（色譜級） 德國Merck公司；乙腈、甲酸（均為質譜級） 美國Fisher Scientific公司；Mili-Q系統美國Milipore公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6545 高分辨四極桿飛行時間液相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；ST16R高速冷凍離心機美國Thermo Fisher Scientific公司；ME802E稱量天平瑞士梅特勒-特利多有限公司；Vortex Genius 3渦旋混合儀 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 復原乳的配制

按蛋白質質量濃度為3.0 g/100 mL將乳粉溶于63 ℃熱水中，手搖均質30 min，配制成復原乳。

1.3.2 樣品前處理

吸取2 mL牛乳于15 mL離心管中，8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，重復3 次；下層轉移至新的15 mL離心管中，加入4 mL乙腈，渦旋5 min，10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min；上清液過0.22 μm有機濾膜后，置于進樣小瓶中，待測。每個樣品6 個平行。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse C18柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相：正離子模式下，流動相A為體積分數為0.2%甲酸水溶液，流動相B為體積分數為0.2%甲酸-乙腈；負離子模式下，流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為5 mmol/L乙酸銨-乙腈；正離子模式下梯度洗脫條件為：0～2.5 min、1%流動相B，2.5～8 min、30%流動相B，8～12 min、50%流動相B，12～20 min、95%流動相B，20～25 min、95%流動相B；負離子模式下梯度洗脫條件為：0～1 min、2%流動相B，1～2 min、10%流動相B，2～5 min、65%流動相B，5～7 min、95%流動相B，7～15 min、95%流動相B，15～15.5 min、5%流動相B；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.3.4 質譜條件

正離子模式：電噴霧離子（electrons pray ionization，ESI）源；干燥器溫度250 ℃；干燥器流速7 mL/min；鞘氣溫度325 ℃；鞘氣流速11 mL/min；毛細管電壓3 000 V；去簇電壓180 V；負離子模式：ESI源；干燥器溫度320 ℃；干燥器流速8 mL/min；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速11 mL/min；毛細管電壓3 500 V；去簇電壓150 V。

1.4 數據處理

利用Mass Hunter Profinder B.06.00 SP1軟件（美國安捷倫公司）對Agilent 6545高分辨質譜儀采集的超高溫滅菌乳和復原乳樣品的色譜峰進行提取、保留時間校準、峰對齊、標準化等預處理，然后進行數據處理。

使用SIMCA-P 14.1軟件進行化學計量學分析。將預處理后的數據導入該軟件中，使用無監督式主成分分析（principal component analysis，PCA）觀察超高溫滅菌乳和復原乳的區分情況，進一步使用偏最小二乘方差判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）方法找到區分2 種乳的表征因子。

使用SPSS 21.0軟件對超高溫滅菌乳和復原乳中各表征因子的含量進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），在95%的概率水平上（P＜0.05）進行測試，得出差異顯著性結果。

2 結果與分析

2.1 正、負離子模式下超高溫滅菌乳和復原乳PCA結果

圖1 正、負離子模式下超高溫滅菌乳和復原乳的PCA結果圖Fig. 1 PCA plots of UHT and reconstituted milk in positive and negative ion modes

基于高分辨質譜積分數據，利用SIMCA-P 14.1軟件，對超高溫滅菌乳和復原乳2 種乳的積分數據進行無監督式PCA。由圖1可知：正離子模式下，主成分1和主成分2的累積貢獻率達0.726；負離子模式下，主成分1和主成分2的累積貢獻率達0.678。結果表明，通過無監督式PCA，2 種乳得到很好地區分，證明通過2 種乳中的內源性小分子物質可以將其區分開。

2.2 正、負離子模式下超高溫滅菌乳和復原乳PLS-DA分析及差異性表征因子篩選

為了找出復原乳和超高溫滅菌乳中的差異性物質，將不同質荷比（m/z）下的各峰面積積分結果進行PLSDA分析。由圖2可知，通過PLS-DA分析，2 種乳得到很好地區分。

通過變量投影重要性（variable importance，VIP）對區別2 種乳有重要貢獻的變量進行篩選。一般來說，當VIP值大于1時，說明該變量對分類有顯著貢獻。因此，提取VIP值大于1的m/z作為區分2 種乳的表征因子，其中正離子中篩選出7 種表征因子，m/z分別為568.567 5、162.113 3、114.066 9、102.127 6、228.197 0、158.154 4和338.343 9，負離子中篩選出的7 種表征因子，m/z分別為193.036 3、195.051 8、165.041 6、179.058 0、683.231 5、112.052 5和192.067 8，正、負離子模式下VIP結果如圖3～4所示。

圖2 正、負離子模式下超高溫滅菌乳和復原乳的PLS-DA分析圖Fig. 2 PLS-DA plots of UHT and reconstituted milk in positive and negative ion modes

圖3 正離子模式下VIP柱狀圖（a）及2 種乳的峰面積積分（b～h）Fig. 3 VIP (a) and peak area integral in UHT and reconstituted milk (b～h) in positive ion mode

圖4 負離子模式下VIP柱狀圖（a）及2 種乳的峰面積積分（b～h）Fig. 4 VIP (a) and peak area integral in UHT and reconstituted milk (b～h) in negative ion mode

表1 正、負離子模式下區分超高溫滅菌乳和復原乳的14 種表征因子的方差分析Table 1 Analysis of variance of 14 biomarkers between UHT and reconstituted milk

進一步，利用SPSS 21.0軟件對以上篩選出的14 種表征因子進行方差分析。由表1可知，篩選出的14 種表征因子在2 種乳中均有高度顯著性差異。因此，利用篩選出的14 種表征因子建立區分超高溫滅菌乳和復原乳的判別模型。

2.3 超高溫滅菌乳和復原乳PLS-DA判別模型構建

根據上述篩選出的14 種表征因子，建立PLS-DA判別模型。一般來說，評價PLS-DA模型擬合效果的指標主要為R2x、R2y和Q2y，這3 個指標越接近1，則代表該模型的擬合效果越好，而Q2y可以用于評價模型預測能力，Q2y越大，模型預測效果越好[22]。由圖5可知，本研究構建的PLS-DA模型，R2x=0.765，R2y=0.934，Q2y=0.893，證明該模型的擬合效果較好，可以很好地判別超高溫滅菌乳和復原乳。

圖5 超高溫滅菌乳和復原乳的二維、三維PLS-DA模型及模型置換驗證結果圖Fig. 5 2D and 3D PLS-DA models and permutation plot of UHT and reconstituted milk

為了驗證模型的有效性，對模型進行置換驗證，以避免該PLS-DA模型的過擬合。置換驗證結果見圖5C。LC-MS檢測獲得的數據陣經過999 次建模獲得的R2y與真實模型的R2y共同構成的回歸線截距為0.073 2，經過999 次建模獲得的Q2y與真實模型的Q2y共同構成的回歸線截距為-0.609 0。理論上，建模獲得的Q2y與真實模型的Q2y共同構成的回歸線截距不大于0.05，證明所建的判別模型未過度擬合，統計學意義顯著[23]。因此，該模型未過度擬合，具有有效性。

3 結 論

由于超高溫滅菌乳和復原乳加熱殺菌溫度相差不大，且部分乳制品企業對牛乳加熱殺菌溫度控制不嚴格，容易使超高溫滅菌乳產生過熱加工[24]，增加復原乳與超高溫滅菌乳的判別難度。因此，目前對復原乳的研究主要集中于生乳、巴氏殺菌乳和復原乳的判別，然而對超高溫滅菌乳和復原乳判別方法的研究較少。本研究利用高分辨四極桿飛行時間質譜儀，結合化學計量學方法，采用非靶向代謝組學方法，建立一種區分超高溫滅菌乳和復原乳的判別模型，該方法既克服了傳統方法判別復原乳前處理復雜、耗時長等問題，又提供了一種判別超高溫滅菌乳和復原乳的方法，實現了對超高溫滅菌乳和復原乳的快速、高效判別，前處理簡單、可靠性高。

所得的14 種差異物質有待后續通過采集二級碎片離子峰、匹配標準物質進行定性分析，以便為更好地找出復原乳和超高溫滅菌乳中的差異物質打下基礎。