艾納香中綠原酸類化學成分研究

元超 王鴻發 胡璇 陳曉鷺 龐玉新

摘 ?要 ?為全面了解海南傳統黎藥艾納香抗菌藥效物質基礎，本研究采用硅膠柱色譜、凝膠色譜以及高效液相色譜技術對艾納香提取物進行系統化學成分研究。結果顯示：共分離鑒定6個綠原酸類成分：3，5-O-二咖啡酰奎尼酸乙酯（1），3，5-O-二咖啡酰奎尼酸甲酯（2），3，4-O-二咖啡酰奎尼酸甲酯（3），3，4-O-二咖啡酰奎尼酸（4），3，5-O-二咖啡酰奎尼酸（5），1，3，5-O-三咖啡酰奎尼酸（6）。化合物1～6均為首次從該植物中分離得到，其中化合物1為新天然產物。抗細菌活性評價顯示化合物3對枯草芽孢桿菌及化合物6對金黃色葡萄球菌均具有較強抑制活性，MIC值均為64 ?g/mL，推測綠原酸類為艾納香的重要抗菌活性組成。

關鍵詞 ?艾納香;抗菌;綠原酸

中圖分類號 ?R284 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?To comprehensively investigate the antimicrobial components of Blumea balsamifera （L.） DC.， a traditional Li Minority herb， various chromatographic methods including silica gel， sephadex LH-20 and ODS-A gel were used to study its chemical constituents. Six isolates including 3，5-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester （DAEE）， 3，5-O-di caffeoylquinic acid methyl ester （DAME）， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid methyl ester （OAME）， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid （DA1）， 3，5-O-dicaffeoylquinic acid （DA2） and 1，3，5-tri-O-caffeoylquinic acid （DA3） were obtained on the basis of detailed spectroscopic analysis. All compounds were isolated from the plant for the first time， and DAEE is a new natural product. Antimicrobial assay exhibited that OAME and DA3 displayed potent inhibitory activity against Bacillus subtilis （DSM 1088） and Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）， respectively， with MIC value 64 ?g/mL， suggesting chlorogenic acids maybe the main active ingredients of Blumea balsamifera （L.） DC.

Keywords ?Blumea balsamifera （L.） DC.; antibacterial; chlorogenic acids

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.020

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]為菊科（Compositae）艾納香屬（Blumea）多年生草本植物，為藥典中艾片的唯一來源植物[1]。其味辛、微苦、性溫、氣香，具溫中活血，消炎鎮痛，祛風消腫等功效[2]，能夠治療風濕關節炎、濕疹、皮膚瘙癢等癥[3]，作為傳統黎藥還被煮水用于婦女產后沐浴[4]。艾納香中主要成分為揮發油、黃酮類和萜類，目前從事艾納香非揮發性化學成分研究的主要包括廣西師范大學的朱廷春[5]，上海交通大學的陳銘[6]，深圳海王藥業的嚴啟新和譚道鵬等[7-8]，以及日本的Osaki等[9]和Osamu等[10]，共報道化學成分50多種，其中黃酮類32種，倍半萜類15種。已有研究對艾納香中的黃酮和萜類成分方面報道較多，相關生物活性主要集中在抗炎活性、細胞毒活性、血漿酶抑制活性等幾個方面，目前艾納香中綠原酸類成分尚未見研究報道。

綠原酸（chlorogenic acid）類化合物為金銀花的主要活性成分[11]，又稱咖啡酰奎尼酸 （caffeoy quinic acid）類化合物，是一類由奎尼酸和不同數目的咖啡酸通過酯化反應縮合而成的酚酸類天然化合物，根據奎尼酸上不同位置取代咖啡酰基數目的不同形成一系列的衍生物，具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗微生物作用，酶抑制活性，肝保護及抑制血小板凝聚等[12]。

艾納香作為具有較好抗菌活性的傳統黎藥在海南黎族百姓中被廣泛應用，而通常一種藥用植物中的化學成分至少都在100種以上，目前對艾納香的化學成分方面的研究報道的化合物數量僅50余種，遠未達到其實際含有化學成分總量。為進一步闡明艾納香作為傳統抗菌藥物的功效物質基礎，本課題組擬在前人研究基礎上對艾納香中除黃酮類和萜類之外的非揮發性成分進行系統研究，以期從中發現其他結構類型抗菌先導化合物，為闡明艾納香的傳統藥用功效物質基礎提供借鑒。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試材料 ?艾納香為2017年采自于海南省儋州市艾納香種質資源圃，經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera （L.） DC.，標本保存于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所南藥室。

供試細菌菌株：Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799），Escherichia coli （DSM 1116） 和 Bacillus subtilis （DSM 1088） 均由青島大學藥學院李剛老師提供。

1.1.2 ?儀器與試劑 ?核磁共振波譜儀（Bruker Avance-500MHz）;液質聯用儀：SYNAPT G2 HDMS超高效液相飛行時間高分辨質譜聯用系統（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;Waters 2489半制備液相色譜系統（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州廣源凈化科技有限公司）。

葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden）;ODS-A反相鍵和硅膠（北京慧德易科技有限責任公司）;高效液相色譜柱YMC-Pack ODS-A，10 ?m，250×10 mm（北京慧德易科技有限責任公司），100～200目柱層析硅膠和GF254薄層硅膠板（青島海洋化工有限公司）;石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇分析純（天津市富宇精細化工有限公司）;色譜甲醇（TEDIA）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?化學成分的分離 ?艾納香葉片（6 kg），陰干，揉碎，用95%甲醇回流提取，合并濾液，減壓濃縮至無醇味（400?g），水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分減壓濃縮至干，得乙酸乙酯浸膏（160 g）。

乙酸乙酯浸膏拌硅膠，上硅膠柱分離，依次用二氯甲烷/甲醇100/0～0/1梯度洗脫，根據薄層色譜檢測，合并，獲得9個組分，分別編號A～I。I組分用甲醇溶解，上ODS反相鍵合硅膠色譜柱，用甲醇/水不同比例洗脫共得到3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%和100%共8個組分（I1～I8），將30%組分（I5）用甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱層析，甲醇為洗脫劑，根據薄層色譜檢測進行合并，獲得單體化合物1（20?mg），2（51?mg）和3（17?mg）。將10%組分（I3）采用半制備高效液相色譜分離，依次獲得3個純化合物：4（14?mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=10.5 min），5（10 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=13.7 min），6（22 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=15 min）。

1.2.2 ?化合物1～6的抑菌活性測定 ?80?℃保存的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp. Aureus），大腸埃希菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株室溫解凍后，接種到LB液體培養基上，37?℃振搖培養過夜，血細胞計數板計數，調整菌懸液濃度為1×108 CFU/mL。將其用MHB培養液（牛肉粉2?g，可溶性淀粉1.5?g，酸水解酪蛋白17.5?g，溶于1?L蒸餾水中，pH 7.4，高壓蒸汽滅菌）稀釋菌液100倍至106 CFU/mL，作為供試菌懸液。采用微量倍比稀釋法[13]測定化合物1～6（圖1）對3株供試菌的抑制活性，化合物1～6分別用DMSO溶解，供試樣品的濃度范圍為128～8 ?g/mL，培養板置37?℃生化培養箱中培養過夜，觀察結果，鏈霉素為陽性對照，所有實驗重復3次，計算最低抑菌濃度（MIC）。

2 ?結果與分析

2.1 ?結構鑒定

2.2 ?抗細菌實驗結果

采用96孔板倍比稀釋法評價6個單體化合物的抑菌活性，鏈霉素為陽性對照。活性結果（表1）顯示化合物6對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）具有較強抑制活性，MIC值為64 μg/mL，化合物3對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis （DSM 1088）也具有一定程度抑制活性，MIC值為64 μg/mL。

3 ?討論

艾納香作為海南傳統黎藥在民間用于清新口氣、沐浴以及外敷治療刀槍傷等外傷傷口，均具有很好的治療效果，暗示了艾納香抗菌以防治傷口感染和加速傷口愈合等方面的作用，黎族百姓親切地稱其為“熊貓葉”。現有藥理學研究顯示，艾納香提取物具有很好的抑菌活性，如鄒婧等[19]報道艾納香葉提取物對4種口腔細菌具有較強抑制活性。陳艷等[20]研究顯示，艾納香提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌具有很好的抑制活性，在0.6 mg/mL濃度下，對3株供試菌株的3個月抑制率均達到80%以上。

目前對艾納香化學成分的研究仍以左旋龍腦、艾油、總黃酮、萜類成分為主，據Pang等[21]2014年統計，已報道的艾納香非揮發性成分共50余種，幾乎全部為黃酮類化合物和倍半萜類成分，其他類型成分報道很少。藥用植物發揮一系列藥理功效的機制通常是多組分、多靶點的，各類成分之間還可能有協同作用，艾納香中的功效物質，除了主要的黃酮類和萜類成分外，是否還含有其他結構類型化合物對其藥用功效具有協同作用，目前尚不清楚。

Pang等[22]對艾納香總黃酮促進大鼠皮膚愈合的研究顯示，艾納香總黃酮提取物具有保護傷口避免感染以及加速傷口愈合功效，研究中通過UPLC-Qtof-MS技術對總黃酮提取物的分析發現，除了黃酮類成分外，其中還含有不同種類的綠原酸類成分，綠原酸類化合物具有很好生物活性，尤其是抗菌方面，Zhu等[23]報道洋薊中的多種綠原酸類化合物對各種細菌和真菌表現出較好的抑制活性，MIC值50～200 μg/mL，因此推測艾納香中總黃酮為保護傷口和促愈合的主要功效成分，同時提取物中的綠原酸類成分可能對總黃酮的藥理功效具有協同作用。本研究從艾納香中分離并鑒定了多種綠原酸類單體成分，其中1種化合物為首次從自然界中分離獲得的新天然產物，6種單體化合物均為首次從該植物中分離，抗菌活性測試顯示多種綠原酸類成分對3種供試細菌表現出不同程度抑制活性。

本研究不僅獲得一系列抗菌活性先導化合物，而且綠原酸類結構為艾納香之前的研究中從未發現過的一類活性成分，同時，本研究進一步驗證了Pang等[22]對總黃酮提取物的UPLC- Qtof-MS分析結果，有助于解釋綠原酸類成分在艾納香提取物的各種藥理功效中的可能發揮的協同作用。

參考文獻

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 2015年版一部 [M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015： 88-89.

梁 ?會， 曹佩雪， 邱凈英， 等. 艾納香化學成分的研究[J]. 時珍國醫國藥， 2011， 22（2）： 308-309.

韋睿斌， 龐玉新， 楊 全， 等. 艾納香黃酮類化學成分研究進展[J]. 廣東藥學院學報， 2014， 30（1）： 123-127.

朱廷春. 艾納香乙酸乙酯萃取部位的化學成分研究[D]. 桂林： 廣西師范大學， 2007.

陳 ?銘. 艾納香的活性成分研究[D]. 上海： 上海交通大學， 2009.

嚴啟新， 譚道鵬， 康 ?暉， 等. 艾納香中的黃酮類化學成分[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2012， 18（5）： 86-89.

譚道鵬， 嚴啟新， 康 ?暉， 等. 艾納香化學成分的研究[J]. 天然產物研究與開發， 2012， 24（6）： 718-721.

Osaki N， Koyano T， Kowithayakorn T， et al. Sesquiterpenoids and plasmin-inhibitory flavonoids from Blumea balsamifera[J]. Journal of Natural Products， 2005， 68（3）： 447-449.

Osamu S， Jennifer M O， Setsuko S， et al. Sesquiterpenes from Blumea balsamifera[J]. Journal of Natural Products， 2011， 74（3）： 470-476.

宋亞玲， 王紅梅， 倪付勇， 等. 金銀花中酚酸類成分及其抗炎活性研究[J]. 中草藥， 2015， 46（4）： 490-495.

趙 ?昱， 趙 ?軍， 李湘萍， 等. 咖啡酰奎尼酸類化合物研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2006， （11）： 869-874.

Yuan C， Wang H Y， Wu C S， et al. Austdiol， citromycetin and fulvic acid derivatives from an endolichenic fungus Myxotrichum sp.[J]. Phytochemistry Letters， 2013， 6： 662–666.

Zhang Y H， Xue M Q， Bai Y C， et al. 3，5-Dicaffe oylquinic acid isolated from Artemisia argyi and its ester derivatives exert anti-leucyl-tRNA synthetase of Giardia lamblia （GlLeuRS） and potential anti-giardial effects[J]. Fitoterapia， 2012， 83（7）： 1281-1285.

Chen J， Mangelinckx S， Ma L， et al. Caffeoylquinic acid derivatives isolated from the aerial parts of Gynura divaricata and their yeast α-glucosidase and PTP1B inhibitory activity[J]. Fitoterapia， 2014， 99： 1.

Wono M， Masuoka C， Odake Y， et al. Antioxidative constituents from Tessaria integrifolia [J]. Food Science & Technology Research， 2000， 6（2）： 106-114.

Wang D J， Du N， Wen L， et al. An efficient method for the preparative isolation and purification of flavonoid glycosides and caffeoylquinic acid derivatives from leaves of Lonicera japonica Thunb. Using High Speed Counter-Current Chromatography （HSCCC） and Prep-HPLC Guided by DPPH-HPLC Experiments[J]. Molecules， 2017， 22（2）： 229.

Brummond K M， Deforrest J E. Synthesis of the naturally occurring （-）-1，3，5-tri-O-caffeoylquinic acid[J]. Synlett Accounts & Rapid Communications in Synthetic Organic Chemistry， 2009， 9（9）： 1517.

鄒 ?婧， 楊 ?全， 龐玉新， 等. 艾納香口腔護理液的處方篩選及其抑菌效果研究[J]. 廣東藥學院學報， 2015， 31（5）： 571-575.

陳 ?艷， 王 ?凱， 楊 ?全， 等. 艾納香婦科洗液處方篩選及抑菌試驗[J]. 中國中醫藥信息雜志， 2017， 24（3）： 87-90.

Pang Y X， Wang D， Fan Z W， et al. Blumea balsamifera--a phytochemical and pharmacological review [J]. Molecules， 2014， 19（7）： 9453-9477.

Pang Y X， Zhang Y， Huang L Q， et al. Effects and mechanisms of total flavonoids from Blumea balsamifera （L.） DC. on skin wound in rats[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 8（12）： E2766.

Zhu X F， Zhang H X， Lo R. Phenolic compounds from the leaf extract of artichoke （Cynara scolymus L.） and their antimicrobial activities[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（24）： 7272-7278.