MS-222在草魚、花鱸、鯽魚組織中的富集與消除

陳永平，韓現芹，陳 建，李春青，孫曉旺，李 彤，李寶華，付志茹

( 農業農村部漁業環境及水產品質量監督檢驗測試中心(天津)，天津 300221 )

隨著人們生活水平的提高，對水產品的消費由溫飽向質量轉變，人們更關注水產品的質量安全和新鮮度[1-2]。水產品質量安全的挑戰主要集中在生產和流通運輸環節。在鮮活水產品長距離運輸過程中因密度大、中途晃動產生應激反應，降低了經濟價值[3]。為避免損傷和死亡，麻醉劑被廣泛應用于水產品的?；钸\輸中[4-7]。目前漁用麻醉劑已有10余種，其中間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)的麻醉效果最好，對水產品安全無害[8]，但會在水產品中殘留，在人體內富集，損害人體生理機能[9-10]。因此使用MS-222后，水產品必須經過一段時間的休藥期才能保證安全。為了保證水產品的食用安全性，國際上對MS-222在水產品中的使用進行了嚴格規定。如美國食品藥品監督管理局規定，以MS-222麻醉的食用魚必須經21 d休藥期才可在市場上銷售[11-12]，加拿大規定的MS-222休藥期為5 d[13-14]。我國對麻醉劑在水產品中的使用并沒有制定相關的限量標準或政策法規，這給MS-222等的使用及監管帶來不便。MS-222對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[8]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[15]麻醉效果的研究表明，不同水產動物的有效麻醉劑量差別較大[16]，但MS-222在草魚(Ctenopharyngodonidellus)、花鱸(Lateolabraxmaculatus)、鯽魚(Carassiusauratus)、鯉魚(Cyprinuscarpio)體內的殘留及消除規律的研究尚未見報道。筆者研究了在水溫(22±2) ℃下，草魚、花鱸、鯽魚在MS-222藥浴10 h后各組織中的殘留和消除特點，以確定合理的用藥方案和休藥期，為藥物殘留標準的限量提供基礎數據，為監控MS-222殘留和水產品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康草魚、花鱸、鯽魚取自天津海升水產養殖有限公司，平均體質量分別為(100±20) g、(110±20) g和(90±20) g，試驗前暫養7 d。試驗在1.5 m×1.2 m×1.0 m的養殖水箱中進行，注入充分曝氣的自來水體積200 L。水溫保持在(22±2) ℃，每種魚各3水箱，每箱60尾。非藥浴期間，每日8：00和18：00投喂，藥浴期間不換水、不投喂。

MS-222標準品(純度>98%，購自美國Sigma-Aldrich公司)；甲醇(Merck公司，色譜純)，甲酸(Merck公司，色譜純)，冰乙酸(國產分析純)，乙酸鈉(國產分析純)；Agela C18固相萃取小柱(6 mL，500 mg，Agela 公司)。

儀器設備：AB 5500 Qtrap 三重四極桿質譜(AB Sciex 公司)；電子天平(Sartorius公司)；高速冷凍離心機(Sigma公司)；高速組織勻漿機(飛利浦公司，轉速10 000 r/min)；MS1 Mini-shaker渦輪振蕩器(IKA公司)；MiLLi-Q純水器(MiLLipore公司)；氮吹儀(Organomation Associates公司)；旋轉蒸發儀(BUCHI公司)；移液器(10、20、100、200、1000 μL，Eppendorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內的富集試驗

參考文獻[13,17]，試驗水箱注入充分曝氣的自來水200 L，MS-222質量濃度為50 mg/L，水溫保持在(22±2) ℃，分別于藥浴0.5、1、2、3、7 h和10 h時，隨機取出草魚、花鱸、鯽魚各3尾。采樣時，用清潔淡水將魚表面的MS-222藥液沖洗干凈。取2 mL一次性注射器，自胸鰭基部插入心臟取血，放入含有0.3 mL 1%肝素鈉的離心管中，混合均勻后離心，取上層血漿，置于-18 ℃保存。取出肝(胰)臟和魚肉，分別進行均質處理，置于-18 ℃保存。

1.2.2 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內的消除試驗

試驗進行10 h后，將草魚、花鱸、鯽魚轉入清潔淡水中進行消除試驗，每種魚3個網箱，每個網箱60尾，試驗過程保持充氣，溶解氧>5 mg/L。在0.5、1、2、4、6、8、16、32、96、120、192、264、336、432、528、624、720 h時，每個水箱隨機選取 3 尾，用清潔淡水將魚體表面的 MS-222藥液沖洗干凈。按1.2.1方法采集血液、肌肉、肝(胰)臟樣品，置于-18 ℃保存。

1.3 MS-222測定方法

采集樣品處理：取均質好的肌肉、肝(胰)臟各2 g，血液2 mL于50 mL離心管中，各加入10 mL 0.2 mol/mL的乙酸—乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)和50%甲醇溶液，均質。用5 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液和5 mL 50%甲醇溶液清洗刀頭，合并提取液，8000 r/min離心10 min。將上清液全部轉移至50 mL梨形瓶中，于40 ℃水浴中減壓旋轉蒸發除去甲醇。離心管中剩余殘渣中加入15 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液，渦旋1 min，8000 r/min離心5 min，重復1次。將上清液與旋蒸后的溶液合并。將待凈化液轉移至依次用3 mL甲醇與3 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液活化的固相萃取柱中，用2 mL 7.5%的甲醇溶液淋洗，抽至近干后用2 mL甲醇和1%乙酸溶液的混合液(體積比1∶1)進行洗脫。洗脫液收集于10 mL離心管中，過0.2 μm微孔濾膜后，待測。

MS-222標準溶液的配制和標準曲線的制備：稱取10.0 mg的MS-222標準品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的標準儲備液。再用甲醇逐級稀釋至2、10、50、100、200、500、1000 ng/mL的混合標準工作液。配制的MS-222標準溶液進行液相色譜—質譜/質譜分析。以目標物選擇離子色譜峰面積為縱坐標，以相應的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

MS-222測定回收率和檢出限：取空白樣品添加一定量的MS-222標準溶液，充分混勻，靜置30 min，每組3個平行，再按照樣品處理方法處理后進樣，根據測定值計算組織中MS-222的含量?？瞻讟悠诽砑恿糠謩e為2、10、100 μg/kg，以MS-222的3倍信噪比(S/N)作為方法檢出限。

色譜—質譜條件：色譜柱Shim-pack XR-ODS (2.2 μm，75 mm×2.1 mm)；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動相: A-0.1%甲酸，B-乙腈(55∶45，V∶V等梯度洗脫)；流速：0.25 mL/min。電噴霧電離源正離子模式，噴霧電壓4500 V，GS1:60，GS2:40，DP：65，EP:10，CXP:10，掃描模式選擇反應監測。選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量(表1)。

表1 目標化合物質譜條件

注：*為定量碎片離子.

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2010計算標準曲線、消除方程及休藥期和繪制。消除方程為：

C=C0e-kt

式中，C表示藥物含量，C0為殘留消除對數曲線的截距(μg/kg或ng/mL)，k表示消除速率常數，t代表消除時間(h)。

2 結 果

2.1 標準曲線與相關系數、方法檢測限及回收率

在1～1000 ng/mL內MS-222質量濃度的線性關系良好，其線性方程分別為y=1.28×104x-2.84×104，r=0.9999。在本試驗條件下，組織中MS-222檢出限為1.0 μg/kg，MS-222檢出限色譜見圖1，定量限為2.0 μg/kg。各組織中低、中、高3個質量濃度加標水平的MS-222平均回收率為71.4%～91.2%，表明分析方法滿足要求。

2.2 MS-222在3種魚組織中的富集

藥浴0～3 h時，草魚、花鱸、鯽魚血液、肌肉中MS-222殘留量呈上升趨勢，0～1 h時，上升快速，1～3 h，上升平緩，此階段MS-222的吸收速率略大于代謝速率，但吸收和代謝趨于平衡，藥浴3 h時MS-222含量達到峰值，藥浴3 h后，呈輕微下降趨勢；0～7 h，3種魚肝(胰)臟中MS-222殘留量總體呈上升趨勢，0～2 h，上升趨勢快速，2～7 h，上升趨緩，麻醉劑的吸收和代謝趨于平衡，藥浴7 h時MS-222含量達到峰值，藥浴7 h后，肝(胰)臟中MS-222殘留量輕微下降；3種魚組織中MS-222的殘留量為C血液>C肝(胰)臟>C肌肉；肝(胰)臟中MS-222殘留量達到峰值的時間均比血液和肌肉中延遲了1 h，3種魚組織中MS-222富集殘留量為C鯽魚血液>C草魚血液>C花鱸血液，C草魚肌肉>C花鱸肌肉>C鯽魚肌肉，C鯽魚肝胰臟>C花鱸肝臟>C草魚肝胰臟(表2)。

圖1 魚樣檢出限加標色譜圖

表2 水溫(22±2) ℃時草魚、花鱸、鯽魚體內MS-222富集殘留量

2.3 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚組織中的消除

在0～720 h內，隨時間的遞增，3種魚各組織中MS-222殘留量逐漸降低，在0～8 h內MS-222殘留量降低速率尤為明顯，在8～528 h內降低速率趨于平緩，624 h后在3種魚血液、肌肉組織中未檢出MS-222殘留，草魚、花鱸、鯽魚肝(胰)臟組織中殘留量分別為3.6、4.8、4.5 μg/kg，在代謝720 h后，3種魚各組織中均未檢出MS-222(表3)。血液和肌肉組織中MS-222代謝速率無明顯差異，肝(胰)臟代謝速率較前兩種組織慢；花鱸富集MS-222殘留較草魚、鯽魚小，草魚、鯽魚組織富集MS-222殘留無明顯差異，MS-222殘留在草魚、花鱸、鯽魚中的消除速率無明顯差異，所有組織中MS-222殘留可以在30 d后代謝完全(表4～表6)，建議在水溫為(22±2) ℃時，MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內的休藥期應為30 d以上。

表3 水溫(22±2) ℃時草魚、花鱸、鯽魚體內的MS-222消除殘留量

表4 MS-222在草魚組織中的藥代動力學參數

注:AUC(0～t),0～t時間內血藥含量—曲線下面積;AUC(0～∞),0～∞時間內血藥含量—曲線下面積;MRT(0～t),0～t時間內血藥平均滯留時間;MRT(0～∞),0～∞時間內血藥平均滯留時間.

表5 MS-222在花鱸組織中的藥代動力學參數

表6 MS-222在鯽魚組織中的藥代動力學參數

3 討 論

3.1 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚不同組織中的富集

藥浴會使MS-222富集到草魚、花鱸、鯽魚的不同組織中，血液中MS-222的殘留量較肝(胰)臟和肌肉高，肝(胰)臟中的殘留量高于肌肉。有研究表明，水產魚類腦組織和血液中MS-222的富集程度低于肌肉和肝臟，且消除速度更快[18]。但是，MS-222在魚體的富集和消除規律也可能與魚體的環境條件、種類以及藥物含量等因素有關。這與MS-222在大菱鲆體內的富集消除規律基本一致[5]。血液、肌肉、肝臟中的MS-222富集殘留量分別在藥浴3、3、7 h后達到峰值，隨后草魚、花鱸、鯽魚的血液、肌肉、肝(胰)臟的殘留量分別比峰值下降了4.5%、6.7%、0.9%，6.3%、7.6%、2.6%，4.9%、6.7%、0.9%。10 h內血液、肌肉、肝(胰)臟的富集殘留草魚和鯽魚較為接近，分別為2236、2266 ng/mL(血液)，1189、1158 μg/kg(肌肉)，2150、2094 μg/kg(肝胰臟)，草魚和鯽魚組織中MS-222富集殘留量均大于花鱸(1739 ng/mL、1282 μg/kg、1812 μg/kg)。

3.2 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚不同組織中殘留量的消除規律

消除半衰期和藥物平均滯留時間是體現藥物在動物體內消除特征的兩個重要參數(表4)。MS-222在草魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中的消除半衰期分別為5.4、6.7、7.9 h；在花鱸血漿、肌肉、肝臟組織中的消除半衰期分別為3.9、5.1、5.7 h；在鯽魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中的消除半衰期分別為4.8、6.3、8.4 h。MS-222在草魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中平均滯留時間分別為93.5、96.2、110.6 h；在花鱸血漿、肌肉、肝臟組織中平均滯留時間分別為96.8、96.2、103.1 h；在鯽魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中平均滯留時間分別為104.7、112.8、110.5 h。MS-222在各組織中的消除速率為V肝(胰)臟

3.3 MS-222休藥期的確定

MS-222在草魚、花鱸、鯽魚組織中的富集和消除代謝規律為制定MS-222在水產品中的休藥期提供了科學依據。本試驗結果表明，在水溫(22±2) ℃下，草魚、花鱸、鯽魚組織中的MS-222殘留消除至檢出限以下需要30 d以上，因此，建議在(22±2) ℃時，MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內的休藥期應為30 d以上。