擬諾卡氏菌骨架對凡納濱對蝦生長及免疫功能的影響

吳佩佩，孟 陽，畢建才，崔青曼，袁春營

( 天津科技大學 海洋與環境學院，天津市海洋環境保護與修復技術工程中心，天津市海洋資源與化學重點試驗室，天津 300457 )

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱南美白對蝦，原產于美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘魯北部至墨西哥灣沿岸，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中，中國科學院海洋研究所于1988年自美國夏威夷引進中國，現已在全國廣泛養殖。但隨著養殖時間的推移，對蝦品種明顯退化，對病害的抵抗力降低，加上養殖環境的惡化，致使病害頻發，嚴重制約我國對蝦養殖業的健康發展。

由于抗生素之類的藥物已受到嚴格控制，所以國內外學者和養殖戶把目光聚焦在免疫增強劑上，希望通過提高養殖對蝦機體的免疫力，增強其抵抗病害和應激的能力，提升對蝦養殖成功率和養殖水平[1-6]。

擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)為一類經典的絲狀放線菌群，其基絲異常發達，能夠斷裂成桿狀或球狀，氣絲發育良好，多為長或短的分枝，Meyer[7]最早對于該類菌進行過描述，截止到2015年12月，擬諾卡氏菌屬已公開發表的新種為42個、亞種為2個[8]。擬諾卡氏菌屬細胞壁組分Ⅲ型，主要由肽聚糖組成。筆者自凡納濱對蝦養殖池底泥中分離出1株擬諾卡氏菌，經過16S rDNA同源序列分析，確定為盧森坦擬諾卡氏菌(N.lucentensis)，將該菌株制備的細胞壁骨架制劑應用于凡納濱對蝦養殖，探討其對對蝦生長及免疫功能的影響，以期為凡納濱對蝦新型免疫增強劑的開發開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 擬諾卡氏菌細胞壁骨架

本試驗室分離純化的盧森坦擬諾卡氏菌發酵液，經過超聲波破碎、離心、胰蛋白酶酶解、脫脂、冷凍干燥，得到白色細胞壁骨架。

1.1.2 凡納濱對蝦

試驗用凡納濱對蝦購自天津鑫永豐水產養殖有限公司，體長(6.86±1.32) cm，體質量(4.21±1.28) g。

1.1.3 試驗用試劑盒

所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 試驗飼料

試驗飼料為自行配制，基礎配方見表1。飼料原料經粉碎后過80目篩，各原料按配比定量后混合均勻，然后加入適量的水揉勻，經雙螺桿擠條機擠壓出直徑為1.0 mm的飼料，60 ℃烘干后剪切成1.5 mm長的顆粒貯存備用。

表1 飼料基礎配方 %

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗設置2個細胞壁骨架組，添加量分別為0.1%和0.2%，1個對照組，每組設3個平行，共計9個處理組。水族箱規格720 mm×490 mm×380 mm，每個水族箱中投放對蝦30尾。

1.2.2 飼養管理

飼養試驗持續4周，投餌量按照對蝦體質量的4%～6%進行投喂，日投喂4次(6:00、11:00、16:00和21:00)，各時間點投喂量占日總投餌量的比值分別為30%、20%、30%和20%。飼養期間連續充氣，水溫27～29 ℃，鹽度18～20，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L。

1.2.3 對蝦樣品的采集與指標測定

1.2.3.1 生長指標

4周養殖試驗結束，分別對每個處理組對蝦進行計數，稱量質量，計算對蝦的存活率及特定生長率：

存活率/%=nt/n0×100%

特定生長率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，n0和nt分別為每個重復對蝦初始尾數和終末尾數，m0和mt分別為初始體質量和終末體質量，t為試驗時間。

1.2.3.2 抗凝血的制備

用1 mL的無菌注射器，按照血淋巴與抗凝劑為1∶2的比例，由每個重復中隨機取出10～12尾蝦，從腹竇部位進行取血。所取抗凝血，一部分直接用于呼吸爆發活性的測定，另一部分離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶活力的測定，另一部分放于-70 ℃超低溫冰箱中保存，用于其他指標的測定。

1.2.3.3 肝胰腺組織勻漿的制備

將抽取血液后的對蝦解剖，取出肝胰腺，置于5 mL離心管中，將肝胰腺置于冰水浴中，加入9倍體積0.05 mol/L、 pH 6.5的磷酸鹽緩沖液放入組織勻漿器中進行勻漿，勻漿液經3000 r/min離心15 min，上清液即為10%肝胰腺組織勻漿，取勻漿液少許，按照南京建成試劑盒說明書，測定勻漿液中可溶性蛋白質含量，其余的4 ℃保存，用于后續指標測定。

1.2.3.4 超氧化物歧化酶的活性

南京建成試劑盒測定超氧化物歧化酶的活性。血清中超氧化物歧化酶活力單位定義：每毫升反應液中超氧化物歧化酶抑制率達到50%時所對應的超氧化物歧化酶量為1個超氧化物歧化酶活力單位(U)；肝胰腺中超氧化物歧化酶活力單位定義：每毫克蛋白質中超氧化物歧化酶抑制率達到50%時所對應的超氧化物歧化酶量為1個超氧化物歧化酶活力單位(U)。

1.2.3.5 一氧化氮合酶活性

南京建成試劑盒測定一氧化氮合酶活性。血清中一氧化氮合酶活力單位定義：每毫升血清每分鐘生成1 nmol一氧化氮為1個酶活力單位(U)；肝胰腺中一氧化氮合酶活力單位定義：每毫克組織蛋白質每分鐘生成1 nmol一氧化氮為1個酶活力單位(U)。

1.2.3.6 丙二醛活性

南京建成試劑盒測定丙二醛的濃度。測定原理：過氧化脂質降解產物中的丙二醛可與硫化巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰，由此測定丙二醛的濃度。

1.2.3.7 酚氧化酶活性

參照南京建成蝦酚氧化酶酶聯免疫檢測試劑盒說明書進行。應用雙抗體夾心法測定樣品中對蝦酚氧化酶水平，標準曲線計算樣品中對蝦酚氧化酶的活性。

1.2.3.8 溶菌酶活性

南京建成試劑盒測定溶菌酶活性。測定原理：在一定密度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細菌細胞壁上的肽聚糖使細菌裂解，體系密度降低，透光度增強，根據透光度變化推測溶菌酶活性(1 μg=80 U)。

1.2.3.9 谷胱甘肽過氧化物酶活性

南京建成試劑盒測定谷胱甘肽過氧化物酶活性。血清中谷胱甘肽過氧化物酶活力單位定義：每0.1 mL血清在37 ℃反應5 min，扣除非酶促反應作用，使反應體系中谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位(U)；肝胰腺中谷胱甘肽過氧化物酶活力單位定義：每毫克蛋白質，每分鐘扣除非酶促反應的作用，使反應體系中谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位(U)。

1.2.3.10 呼吸爆發活性

參考文獻[9]的方法略有改動。取100 μL抗凝血，加入100 μL(1 μg/mL)佛波醇—肉豆蔻酸—乙酯，37 ℃溫育30 min，然后加入100 μL 0.3%氯化硝基四氮唑藍，37 ℃溫育30 min，5000 r/min，4 ℃，離心10 min，去除上清液，加入200 μL純甲醇終止反應，10 min后，5000 r/min，4 ℃，離心10 min，去除上清液，然后用70%甲醇反復洗滌3次，最后一次離心去除上清液后，于室溫下晾干，經干燥后，加入120 μL 12 mol/L KOH和140 μL二甲基亞砜，充分溶解，在酶標儀上測定630 nm處的吸光值(OD630)。呼吸爆發活性表示為OD630。

1.2.4 攻毒試驗

投喂28 d后，對3個試驗組剩下的對蝦各取11尾進行攻毒，第3腹節肌肉注射副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)菌懸液(1.2×108cfu/mL) 0.1 mL，對照組中注射相同劑量的生理鹽水，記錄接種7 d后各組對蝦的累積死亡率。

1.2.5 數據處理與分析

各處理組數據進行單因素方差分析。以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 細胞壁骨架對凡納濱對蝦生長及存活率的影響

試驗結束后，統計各處理組對蝦死亡尾數，測定各存活對蝦體質量，計算存活率和特定生長率，結果見圖1、圖2。添加0.1%骨架制劑的凡納濱對蝦的特定生長率和存活率最高，極顯著高于對照組(P<0.01)，0.2%骨架制劑添加組對蝦的特定生長率和存活率極顯著高于對照組(P<0.01)。由此可見，飼料中添加擬諾卡氏菌細胞壁骨架制劑，能夠顯著提高凡納濱對蝦的生長和成活率，且以0.1%的添加最適宜。

圖1 不同處理組凡納濱對蝦的特定生長率比較*>*表示與對照組相比，差異極顯著(P<0.01).下同.

圖2 不同處理組凡納濱對蝦的存活率比較

2.2 細胞壁骨架對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶活性的影響

對不同處理組的對蝦進行了血清和肝胰腺中超氧化物歧化酶活性的分析比較，結果見表2。擬諾卡氏菌細胞壁骨架均能極顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺中超氧化物歧化酶的活性(P<0.01)，添加0.1%的擬諾卡氏菌細胞壁骨架，能顯著提高凡納濱對蝦血清中超氧化物歧化酶的活性(P<0.05)。

表2 不同處理組凡納濱對蝦超氧化物歧化酶活性比較

注：*表示與對照組相比，差異顯著(P<0.05)；*>*表示與對照組相比，差異極顯著(P<0.01).下同.

2.3 細胞壁骨架對凡納濱對蝦一氧化氮合酶活性的影響

一氧化氮既可通過殺傷、抑制病原體發揮抗感染的作用，同時也參與對宿主免疫病理的調節，一氧化氮的合成有賴于一氧化氮合酶的催化作用。不同處理組凡納濱對蝦一氧化氮合酶活性測定結果表明，擬諾卡氏菌細胞壁骨架制劑均能顯著提高凡納濱對蝦血清及肝胰腺組織中的一氧化氮合酶活性(P<0.05，P<0.01)(表3)。

表3 不同處理組凡納濱對蝦一氧化氮合酶活性比較

2.4 細胞壁骨架對凡納濱對蝦丙二醛的影響

生物體內，自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為丙二醛，其會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性。不同處理組凡納濱對蝦丙二醛測定結果表明，擬諾卡氏菌細胞壁骨架制劑的添加均能極顯著降低凡納濱對蝦血清及肝胰腺組織中的丙二醛濃度(P<0.01)(表4)。

表4 不同處理組凡納濱對蝦丙二醛濃度的比較

2.5 細胞壁骨架對凡納濱對蝦酚氧化酶活性的影響

不同處理組凡納濱對蝦酚氧化酶活性的測定結果見表5，飼料中添加0.1%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，能夠顯著提高凡納濱對蝦血清和肝胰腺組織中的酚氧化酶活性(P<0.05，P<0.01)，添加0.2%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，雖然也能顯著提高對蝦血清和肝胰腺組織中的酚氧化酶活性(P<0.05)，但作用程度弱于0.1%擬諾卡氏菌細胞壁骨架添加組。

表5 不同處理組凡納濱對蝦酚氧化酶活性的比較

2.6 細胞壁骨架對凡納濱對蝦溶菌酶活性的影響

飼料中添加0.1%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，能夠顯著提高凡納濱對蝦血清和肝胰腺組織中的溶菌酶活性(P<0.05，P<0.01)，添加0.2%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，能夠極顯著提高對蝦血清中的溶菌酶活性(P<0.01)，明顯提高對蝦肝胰腺組織中溶菌酶

活性，但未達顯著性差異水平(P>0.05)(表6)。

表6 不同處理組凡納濱對蝦溶菌酶活性的比較

2.7 細胞壁骨架對凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

不同處理組凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化物酶活性的測定結果見表7。飼料中添加0.1%和0.2%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，均能夠顯著提高凡納濱對蝦血清和肝胰腺組織中的谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05，P<0.01)。

表7 不同處理組凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化物酶活性的比較

2.8 細胞壁骨架對凡納濱對蝦血液呼吸爆發活性的影響

飼料中添加0.1%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，能夠極顯著提高凡納濱對蝦血淋巴中的呼吸爆發活性(P<0.01)，添加0.2%擬諾卡氏菌細胞壁骨架，能顯著提高對蝦血淋巴中呼吸爆發活性(P<0.05)(表8)。

表8 不同處理組凡納濱對蝦呼吸爆發活性的比較

2.9 細胞壁骨架對凡納濱對蝦攻毒死亡率的影響

對于各處理組剩余的凡納濱對蝦，各取11尾進行副溶血弧菌攻毒試驗，統計死亡率，結果見圖3，與對照組比較，對蝦飼料中添加細胞壁骨架后，對蝦死亡率明顯降低，0.1%添加組的死亡率為54.55%，0.2%添加組的死亡率為63.64%，而對照組的死亡率高達81.82%，由此可見，細胞壁骨架可以明顯提高凡納濱對蝦的機體免疫力，從而降低攻毒死亡率。

圖3 副溶血弧菌攻毒后不同處理組凡納濱對蝦死亡率的比較

3 討 論

3.1 細胞壁骨架對凡納濱對蝦酚氧化酶活性的影響

β-葡聚糖、肽聚糖和免疫多糖等，具有提高蝦類免疫功能的作用[10-13]。甲殼動物具有脂多糖受體蛋白、葡聚糖受體蛋白等多種受體結合蛋白，這些受體蛋白能夠識別并結合特定的免疫多糖，誘發機體的酚氧化酶原激活系統，進而產生酚氧化酶，在氧分子存在下，該酶能把酚類氧化成成醌，醌類可抑制微生物的感染；同時，免疫多糖還可以刺激顆粒細胞脫顆粒釋放出免疫活性物質，增強血細胞的吞噬活性，提高消滅病原體的能力[14]。劉小玲等[15]通過研究樺褐孔菌多糖對凡納濱對蝦生長和血清免疫相關酶活性的影響，發現樺褐孔菌多糖能夠顯著促進凡納濱對蝦幼蝦的生長，增強對蝦血清溶菌酶、堿性磷酸酶活性和總抗氧化能力，降低血清丙二醛含量；飼料中添加美人魚發光桿菌(Photobacteriumdamselae)，也能夠提升凡納濱對蝦非特異性免疫水平，增強抵抗疾病的能力[16]。本試驗研究發現，對蝦飼料中添加擬諾卡氏菌細胞壁骨架，可能誘發了對蝦機體的酚氧化酶原激活系統，從而顯著增強了凡納濱對蝦酚氧化酶的活性，抑制了副溶血弧菌的感染，降低了攻毒后的死亡率。

3.2 細胞壁骨架對凡納濱對蝦生化活性的影響

超氧化物歧化酶是一種源于生命體的活性物質，是生物體內重要的抗氧化酶；一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮既可以通過殺傷、抑制病原體發揮抗感染的作用，又可以參與對宿主免疫病理的調節[17]；丙二醛濃度的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度；溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，致使細胞壁破裂，內容物逸出，細菌溶解；谷胱甘肽過氧化物酶是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能催化谷胱甘肽變為氧化型谷胱甘肽，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害；呼吸爆發是氧依賴性吞噬細胞殺菌途徑之一，常常作為衡量吞噬細胞活力的重要指標之一。本研究中采用超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、丙二醛、溶菌酶、谷胱甘肽過氧化物酶和血液呼吸爆發活性作為凡納濱對蝦的免疫學指標，研究了擬諾卡氏菌細胞壁骨架對這些免疫學指標的影響，結果發現，0.1%含量的擬諾卡氏菌細胞壁骨架制劑顯著提高除丙二醛濃度外的凡納濱對蝦系列免疫指標的活性，顯著降低丙二醛濃度，從而提高了對蝦的機體免疫力和養殖成活率，同時發現，增加骨架制劑的使用量，并未增強對蝦免疫指標的活性，反而有所降低，分析原因，可能是產生了免疫疲勞。總之，適量的細胞壁骨架制劑有望作為一種新型對蝦免疫增強劑被進一步開發利用。