超高效液相色譜-串聯質譜同時測定鹽堿脅迫金銀花中3種內源激素

李天雪 胡玉濤 韋笑

摘要：建立同時測定金銀花中水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法，并應用于鹽堿脅迫下的金銀花分析。激素經異丙醇/甲酸溶液（99/1，體積分數）提取后，通過固相萃取（SPE）柱凈化。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相為0.1%甲酸溶 液- 乙腈;體積流量為0.4 mL/min;進樣量為3 μL;質譜采用電噴霧離子源負離子模式（ESI-），多反應監測（MRM）進行測定。3種內源激素具有良好的線性關系（R2≥0.998），最低定量限均為0.5 μg/L，穩定性良好，提取回收率在 81.5%～93.8%之間，精密度的RSD值為2.7%～7.9%之間，該法快速可靠，可適用于其他植物中SA、ABA和JA的含量檢測。利用該方法測定鹽堿脅迫下金銀花中的3種內源激素，比較分析它們在鹽堿脅迫下的含量變化規律，為內源激素對植物的逆境調控機制提供研究基礎。

關鍵詞：金銀花;鹽堿脅迫;水楊酸;脫落酸;茉莉酸;定量;超高效液相色譜-串聯質譜

中圖分類號：S567.7+90.1?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0229-05

江蘇省地處黃海之濱，沿海鹽堿灘涂面積達到 0.76萬km2，引種經濟型耐鹽植物，可更有效地開發利用鹽堿灘涂土地資源。金銀花是一種能耐鹽堿、耐干旱的多年生灌木植物，此外，金銀花作為一種常用中藥，具有清熱解毒、涼風散熱、保肝利膽等作用，因有較高的觀賞和藥用價值，是理想的鹽堿地經濟植物[1]。鹽堿脅迫對作物產量、植物幼苗生理特性有顯著影響[2-6]，植物內源激素作為信號分子，在調節植物代謝以提高植物對逆境的抗性方面起著關鍵作用[7]，內源激素主要有水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA），研究內源激素動態變化規律，可有助于金銀花抗逆境機制的研究，為金銀花在鹽堿灘涂的大面積種植提供一定的技術參考。

ABA是在高等植物中含量較高的植物激素，與種子休眠、幼苗生長、葉子脫落、氣孔運動等都有著密切的關聯，同時也是主要的應激激素，以調控植物的抗逆反應[8-9]。SA和JA都是特定生育環境刺激下誘導產生的植物激素，SA是植物生長抑制劑，抑制頂端分生組織生長，促進側枝生長，屬于一種重要的調控植物抗逆反應的應激激素，研究表明，鹽脅迫下，SA可促進根莖生長，增加植株的鮮質量[10-11]。JA是參與植物抗性反應的一種重要信號分子[12]，在調控植物種子萌發、胚胎發育、幼苗發育、果實成熟、葉片衰老等方面起著重要的作用，尤其在植物干旱、鹽脅迫等逆境脅迫應答中作用更為明顯[13-15]。各種激素相互協同參與調控植物的生理過程，因此，同時測定SA、ABA和JA含量對金銀花植物生理、逆境發育和作物生產等領域的研究具有重要意義。

目前植物激素的檢測方法主要包括酶聯免疫（ELISA）法[16-17]、毛細管電泳法[18-19]、電化學生物傳感器檢測法[20]、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法[21]、高效液相色譜（HPLC）法[22-25]、液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）法[8，26-29]。因超高效色譜分離技術的應用，加上質譜的精確性高、選擇性強，超高液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法被認為是測定內源植物激素最靈敏、可靠的方法[30]。本研究建立了UPLC-MS/MS法并用其同時檢測金銀花中SA、ABA和JA這3種內源植物激素，并用于鹽堿脅迫下金銀花樣品的分析，研究結果將為植物內源激素的合理開發、金銀花的高效培育提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1290 Infinity LC-6460 QqQ三重四級桿串聯質譜儀，配有G4220A四元低壓梯度泵和MassHunter Version B.04.00工作站（美國安捷倫科技公司）;Oasis HLB SPE柱（規格3 cc/60 mg，美國沃特世公司）;Visiprep 24TM DL固相萃取儀（美國Supelco公司）;Eppendorf 5427 R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）;氮吹儀N-WVAPTM 112（美國Organomation公司）。

標準品SA、ABA和內標阿魏酸由南通經緯生物科技有限公司提供，JA購自美國Sigma-Aldrich公司，純度均≥99%;甲醇（Sigma公司）、乙腈（Merk公司）、甲酸（上海安譜公司）為色譜純;超純水經過Milli-Q系統純化制備;其余試劑均為分析純，購自國藥集團。

1.2 儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脫：0～3 min，10%～40%乙腈;3～6 min，40%～60%乙腈;6～8 min，60%～80%乙腈;系統平衡3 min;體積流量 0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量3 μL。

質譜采用電噴霧負離子源（ESI-源），多反應監測模式（MRM）;駐留時間為50 ms;檢測電壓：3.5 kV;離子源溫度：120 ℃;錐孔電壓：220 V;脫溶劑溫度：350 ℃;脫溶劑氣體（N2）體積流量：8 L/min;鞘氣流速：11 L/min。SA、ABA和JA檢測離子的質核和碰撞電壓分別是質荷比137→93，35 eV;質荷比263→153，15 eV和質荷比209→59，14 eV。MRM質譜圖見圖1。

1.3 樣品處理

[8]蘇 適，李瑞航，郎丹瑩，等. 用改進的SPE-LC-ESI-MS/MS法測定小麥葉片ABA含量[J]. 分子植物育種，2015，13（8）：1850-1856.

[9]侯升杰，朱 江，丁明玉. 液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定冬青芽中的脫落酸[J]. 分析試驗室，2009，28（3）：96-98.

[10]Jayakannan M，Bose J，Babourina O，et al. Salicylic acid in plant salinity stress signalling and tolerance[J]. Plant Growth Regulation，2015，76（1）：25-40.

[11]Morad M，Sara S，Mohammad D，et al. Effect of salicylic acid on alleviation of salt stress on growth and some physiological traits of wheat[J]. International Journal of Biosciences，2013，3（2）：20-27.

[12]李夢莎，閻秀峰. 植物的環境信號分子茉莉酸及其生物學功能[J]. 生態學報，2014，34（23）：6779-6788.

[13]馮孟杰，徐 恒，張 華，等. 茉莉素調控植物生長發育的研究進展[J]. 植物生理學報，2015，51（4）：407-412.

[14]巫建華，賈思振，馮英娜，等. 茉莉酸合成關鍵酶基因FaOPR3調控草莓果實成熟[J]. 江蘇農業學報，2016，32（5）：1148-1154.

[15]郭正兵，韓柏明，郭 強. 茉莉酸甲酯對高溫脅迫、生物蠶食無花果幼苗的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（20）：138-143.

[16]Quarrie S A，Whitford P N，Appleford N E，et al. A monoclonal antibody to（S）-abscisic acid：its characterization and use in radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves[J]. Planta，1988，173（3）：330-339.

[17]Lovelli S，Scopa A，Perniola M，et al. Abscisic acid root and leaf concentration in relation to biomass partitioning in salinized tomato plants[J]. Journal of Plant Physiology，2012，169（3）：226-233.

[18]Liu X，Ma L，Lin Y W，et al. Determination of abscisic acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A，2003，1021（1/2）：209-213.

[19]Ross A R，Ambrose S J，Cutler A J，et al. Determination of endogenous and supplied deuterated abscisic acid in plant tissues by high-performance liquid chromatography-electro-spray ionization tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring[J]. Analytical Biochemistry，2004，329（2）：324-333.

[20]Li Q，Wang R Z，Huang Z G，et al. A novel impedance immunosensor based on O-phenylenediamine modified gold electrode to analyze abscisic acid[J]. Chinese Chemical Letters，2010，21（4）：472-475.

[21]Jia K，Feng X M，Liu K，et al. Development of a subcritical fluid extraction and GC-MS validation method for polychlorinated biphenyls （PCBs） in marine samples[J]. Journal of Chromatography B，2013，923（3）：37-42.

[22]Gupta V，Kumar M，Brahmbhatt H，et al. Simultaneous determination of different endogenetic plant growth regulators in common green seaweeds using dispersive liquid-liquid microextraction method[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（11）：1259-1263.

[23]趙曉菊，唐中華，郭曉瑞，等. 固相萃取富集-高效液相色譜法測定長春花中的3種內源激素[J]. 色譜，2006，24（5）：534-534.

[24]趙曼麗，楊迎春，楊世杰，等. 駱駝刺根狀莖中3種植物激素的分離與含量測定[J]. 安徽農業科學，2012，40（14）：8092-8093，8164.

[25]王水良，王 平，王趁義. 固相萃取-高效液相色譜法測定馬尾松組織中內源激素[J]. 分析科學學報，2010，26（5）：547-550.

[26]Pan X Q，Welti R，Wang X M. Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J]. Phytochemistry，2008，69（8）：1773-1781.

[27]劉雪梅，趙 鵬，徐繼林，等. LC-MS同時測定大型海藻中9個植物激素[J]. 藥物分析雜志，2012，32（10）：1747-1752.

[28]鐘冬蓮，丁 明，湯富彬，等. 高效液相色譜-串聯質譜同時測定毛竹筍中4種內源性植物激素[J]. 分析化學，2013，41（11）：1739-1743.

[29]鐘冬蓮，任傳義，李祖光，等. HPLC-MS/MS法同時測定馬尾松松針中水楊酸和茉莉酸[J]. 分析試驗室，2017，36（2）：164-167.

[30]Mueller M，Munne-Bosch S. Rapid and sensitive hormonal profiling of complex plant samples by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Plant Methods，2011，7（1）：37.

[31]郭菊梅，陳紅剛，曹 瑞，等. 氯化鈉濃度對黃芩幼苗生長情況及生理指標的影響[J]. 中國藥房，2014，25（47）：4497-4499.

[32]US FDA. Guidance for industry：bioanalytical method validation[Z]. US FDA，2001.

[33]Ryu H，Cho Y G. Plant hormones in salt stress tolerance[J]. Journal of Plant Biology，2015，58（3）：147-155.

[34]Wang X Q，Ullah H，Jones A M，et al. G protein regulation of ion channels and abscisic acid signaling in Arabidopsis guard cells[J]. Science，2001，292（5524）：2070-2072.

[35]Li W Q，Yamaguchi S，Khan M A，et al. Roles of gibberellins and abscisic acid in regulating germination of suaeda salsa dimorphic seeds under salt stress[J]. Frontiers in Plant Science，2016，6（1）：1235.

[36]Kang D，Seo Y，Lee J D，et al. Jasmonic acid differentially affects growth，ion uptake and abscisic acid concentration in salt-tolerant and salt-sensitive rice cultivars[J]. Journal of Agronomy and Crop Science，2005，191（4）：273-282.

[37]Pedranzani H，Racagni G，Alemano S，et al. Salt tolerant tomato plants show increased levels of jasmonic acid[J]. Plant Growth Regulation，2003，41（2）：149-158.

[38]Chanjirakul K，Wang S Y，Wang C Y，et al. Effect of natural volatile compounds on antioxidant capacity and antioxidant enzymes in raspberries[J]. Postharvest Biology and Technology，2006，40（2）：106-115.