翻壓不同綠肥對植煙土壤細菌類群的影響

王飛 徐茜 陳志厚

摘要：為探討綠肥對植煙土壤細菌的影響，以烤煙K326為研究對象，設置CK（不翻壓綠肥）、T1（翻壓光葉苕子）、T2（翻壓黑麥草）和T3（翻壓紫云英）等4個處理。結果表明，與CK相比，T2處理土壤細菌在種分類水平上豐度增加得最多;T1、T2、T3處理明顯提高土壤細菌α多樣性;旺長期土壤細菌豐度超過2%的屬分別是浮霉狀菌屬（Planctomyces）、假絲酵母菌屬（Candidatus Solibacter）、羅丹菌屬（Rhodanobacter）、紅游動菌屬（Rhodoplanes），成熟期土壤細菌豐度超過2%的屬為水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、Planctomyces、普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）;冗余分析結果表明，旺長期土壤速效鉀含量解釋了細菌23.50%的變化，成熟期土壤有機質含量解釋了細菌群落23.50%的變化;T1、T2、T3處理在旺長期均能顯著降低煙草青枯病致病菌（Ralstonia）豐度，T3處理顯著增加了旺長期和成熟期土壤中苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、固氮螺菌屬（Inquilinus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等3個固氮菌屬豐度。說明翻壓綠肥可以在一定程度上改善植煙土壤細菌結構。

關鍵詞：綠肥;烤煙;土壤細菌結構;豐度;16S rDNA測序;多樣性指數;土壤微生物群落;連作障礙

中圖分類號： S154.3;S142? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0317-05

土壤微生物是陸地生態系統重要的分解者，地球生物化學過程中的固氮、硝化與反硝化、甲烷氧化、二氧化碳固定等諸多過程都與之密切相關[1]。土壤微生物群落結構受多方面影響，會隨著自然環境中二氧化碳、臭氧、酸雨等環境因子的變化而改變[2]。人類對土地的耕作和管理方式也會影響土壤微生物多樣性，在農業生產中，施肥和農藥是影響土壤微生物系統穩定性的兩大主導因素[3]。Fauci等研究表明，大量使用氮肥會顯著降低土壤微生物活性，增施有機肥則可以提高土壤微生物活性[4-5]。

土壤微生物學興起于19世紀60年代[6]，隨后關于土壤微生物的研究方法一直都在改進，Garland等發明提出采用生理學方法（GLPP）研究土壤酶[7]，Torsvik在前者的基礎上提出采用生態微平板法（EcoPlates）專門研究土壤微生物[8]。20世紀70年代，White等采用磷脂脂肪酸（PLFA）圖譜分析法來鑒定微生物種屬[9]，隨著科技的發展，高通量測序法憑借其準確性高、測序量大的特點受到人們的青睞[6]。

煙草為重要的經濟作物，連作和增施化肥都會影響其根際土壤微生物環境，土壤微生物系統的改變會引起土壤肥力下降和土壤理化性質不協調，進而導致煙草連作障礙[10]。因此，許多科研工作者致力于從土壤微生物方面解決煙草連作障礙問題。關于煙田土壤微生物群落結構的研究已有不少報道[11]，諸如探討烤煙連作[12]、套作[13]、輪作[14]、秸稈還田[15]、移栽方式[16]等對植煙地土壤微生物的影響，而關于綠肥還田對植煙地土壤細菌群落、功能微生物影響的報道相對較少。因此，本研究結合16S rDNA高通量測序技術來探究翻壓光葉苕子（Vicia villosa Roth var.）、黑麥草（Lolium perenne L.）、紫云英（Astragalus sinilus L.）等3種綠肥植物對植煙地土壤細菌群落結構、多樣性指數和功能菌的影響，旨在為從土壤微生物群落角度解決煙草連作障礙問題積累數據，為提高烤煙品質服務。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建省南平市光澤縣寨里鎮小寺州村（117°39′E，27°38′N），屬中亞熱帶氣候，年平均氣溫為 17.5 ℃，年降水量為1 800 mm，年極高、極低溫分別為39.70、-9.50 ℃，無霜期為271 d。烤煙移栽前土壤有機質含量為17.43 g/kg，堿解氮含量為183.56 mg/kg，有效磷含量為39.03 mg/kg，速效鉀含量為100.08 mg/kg，交換性鈣含量為225.66 mg/kg，交換性鎂含量為46.49 mg/kg。土壤細菌的香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數分別為8.013、0.001。

1.2 材料

光葉苕子、黑麥草、紫云英種子采購于山東藍天種業專業種子公司，千粒質量分別為70.74、3.28、9.62 g，在試驗地發芽率分別為35.00%、80.00%、35.00%。供試烤煙品種為K326。

1.3 試驗設計

試驗時間為2016年11月至2017年7月。采用隨機區組試驗設計，設置CK（不翻壓綠肥）、T1（翻壓光葉苕子）、T2（翻壓黑麥草）和T3（翻壓紫云英）等4個處理，每個處理重復3次，每個重復小區面積為24 m2。綠肥植物在2016年11月采用撒播方式播種，根據綠肥植物種子發芽率和千粒質量，將3種綠肥植物成活密度控制為200株/m2。在烤煙移栽前 20 d 同時翻壓3種綠肥植物，翻壓時光葉苕子、黑麥草、紫云英的鮮生物量分別為4 600.05、6 800.32、4 700.58 kg/hm2。烤煙播種時間為2016年12月5日，移栽至試驗地時間為2017年2月18日，基肥為煙草專用肥（施用量為 480.00 kg/hm2）以及鈣鎂磷肥（施用量為150.00 kg/hm2），基肥施用時間為移栽前20 d;追肥為硝酸鉀（施用量為 300.00 kg/hm2），追肥時間為移栽后30、60 d，煙田行距為 1.20 m，株距為0.50 m。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤化學性質測定 分別于煙草生長的旺長期、成熟期在煙壟上2棵煙株的正中位置（避開施肥點），采用3點混合的方式采集0～20 cm耕作層土壤，用滅菌的自封袋裝好后，用保鮮箱帶回實驗室，剔除雜物，一部分用于檢測土壤細菌類群，另一部分風干后混合均勻過2.0、0.149 mm篩，用于測定土壤化學性質。土壤有機質、全氮含量采用元素分析儀（Elementer公司生產的Vario MAX CN）測定;堿解氮含量采用堿解擴散法測定;有效磷含量采用NaHCO3浸提后用分光光度計測定;速效鉀含量用1 mol/L CH3COONH4浸提后，用火焰光度計測定;交換性鈣、交換性鎂含量用1 mol/L CH3COONH4浸提后，用原子吸收分光光度計測定;土壤pH值用 1 mol/L KCl浸提測定[17]。

1.4.2 土壤細菌類群測定 土壤細菌類群采用16S rDNA高通量測序法測定，具體操作過程如下。

1.4.2.1 提取土壤微生物DNA 采用MoBio96試劑盒提取土壤微生物DNA。

1.4.2.2 PCR擴增 從樣本中提取基因組DNA后，用帶有條形碼（bar code）的特異引物擴增16S rDNA的V3+V4區。引物序列為341F：CCTAYGGGRBGCASCAG;806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT。然后對PCR擴增產物進行切膠回收，用Quanti FluorTM熒光計進行定量。再將純化的擴增產物進行等量混合、連接測序接頭、構建測序文庫，最后利用Hiseq2500 PE250上機測序。

1.4.2.3 Tag拼接和過濾 將測序結果中含N堿基比例超過10%的序列和質量值高于20的且堿基數在堿基總數中占比小于40%的堿基序列（reads）去除，根據測序序列（paired-end reads，簡稱PE reads）之間的重疊關系將成對雙端reads拼接為原始條帶（raw tags）。然后在堿基位點截斷raw tags，從連續低質量值（默認質量閾值為≤3）堿基數達到設定長度（默認長度值為3）的第1個低質量堿基位點，得到的條帶（tags）數據集之后過濾掉其中連續高質量堿基長度小于tags長度75%的tags。

1.4.2.4 OTU聚類分析 將相似性達到97%的有效tags聚成操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTUs），計算出每個OTU在各個樣品中的tags絕對豐度和相對信息，用于分析多樣性指數。

1.4.3 數據處理 數據分析采用SPSS 21.0完成，制圖采用SigmaPlot12.5、Canoco4.5完成。

2 結果與分析

2.1 不同處理對植煙土壤細菌各分類水平豐度的影響

由圖1、圖2、圖3可以看出，初始、旺長期、成熟期土壤細菌的稀釋曲線隨著序列數的增加逐漸變緩，說明隨著序列數的增加，細菌數目趨于穩定，表明取樣合理。

由圖4可知，各時期不同處理土壤細菌種的相對豐度普遍低于20%，細菌屬水平上的相對豐度在20%～40%之間，細菌科水平上的相對豐度在40%～60%之間，土壤細菌目及以上水平的相對豐度均超過60%。各生長期不同處理土壤細菌種水平以上的門類在所有分類水平中的比例變化不明顯，而土壤細菌種的豐度變化較大。初始土壤細菌種的豐度僅為0.48%，各處理旺長期土壤細菌種的豐度均大于1%，與CK處理相比，T1、T2、T3處理土壤細菌種的豐度分別增長了15.68%、21.57%、14.71%，成熟期土壤細菌種的豐度均超過5%，尤其是T2處理，豐度達到了9.31%。

2.2 不同處理對植煙土壤細菌α多樣性的影響

Shannon指數和Simpson指數代表細菌多樣性，表1為旺長期與成熟期土壤細菌Shannon指數和Simpson指數。方差分析結果表明，旺長期和成熟期土壤細菌Shannon指數和Simpson指數均明顯高于初始土壤。旺長期Shannon指數大小表現為T2處理>T3處理>T1處理>CK處理，其中T2、T3處理顯著大于CK處理;Simpson指數大小表現為T2處理>T3處理=T1處理>CK處理，T1、T2、T3處理均與CK處理差異顯著;成熟期Shannon指數大小表現為T3處理>T1處理>T2處理>CK處理，其中T3處理顯著高于CK處理，T1、T2、T3處理差異不顯著。由此可見，綠肥翻壓有助于提高土壤細菌α多樣性。

2.3 植煙土壤屬分類水平細菌與土壤養分的冗余關系分析

由表2可知，烤煙旺長期T1、T2、T3處理土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣、交換性鎂含量大多顯著高于高于CK處理。與CK處理相比，T2處理對土壤有機質含量提高得最多，在旺長期、成熟期分別比CK處理高了3.71%、7.59%。T3處理對土壤堿解氮、交換性鈣、交換性鎂含量提高幅度最大，土壤堿解氮含量的提高說明紫云英固氮作用顯著。T1、T2、T3處理的土壤pH值在烤煙旺長期與CK處理無顯著差異，而在成熟期顯著低于CK處理。

由圖5可知，CK、T1、T2、T3處理旺長期土壤細菌數量分別為158.00、151.33、157.67、147.00個，成熟期分別為 373.00、369.33、382.00、403.33。旺長期和成熟期各處理間土壤細菌數量均無顯著差異，而同一處理成熟期土壤細菌數量均顯著大于旺長期。

圖6、圖7分別為旺長期、成熟期土壤細菌豐度大于2%的屬分類水平細菌。旺長期4個處理中未分類屬的豐度均超過 77.00%，其他屬豐度均超過12.00%;可分類的屬為浮霉狀菌屬（Planctomyces）、假絲酵母菌屬（Candidatus Solibacter）、羅丹菌屬（Rhodanobacter）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）等;T3處理土壤中Planctomyces、Rhodanobacter 2個屬豐度均高于其他處理，分別比CK處理高128.55%、37.44%。T2處理土壤中Candidatus Solibacter、Rhodoplanes 2個屬豐度高于其他3個處理，分別比CK處理高55.68%、7.48%。與旺長期相比，成熟期土壤細菌豐度大于2%的屬差異較大，分別為水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、Planctomyces、普雷沃氏菌屬（Prevotella_9），其中Mizugakiibacter豐度在T1處理下最大，比CK處理高165.41%;Planctomyces豐度在T1處理下為2.31%，高于CK處理。T2處理有利于Prevotella_9豐度的提高，與CK處理相比，提高240.66%。

將屬水平上的細菌與土壤中環境因子作冗余分析，結果如圖8、圖9所示。圖中環境因子與細菌夾角的余弦值絕對值大小代表相關性強弱。當夾角呈銳角時，表示兩者正相關，夾角越小，則余弦值越大，相關性越強，反之越弱;當夾角為鈍角時，表示兩者負相關，夾角越大，則余弦值絕對值越大，相關性越強，反之越弱。旺長期第1主軸可以解釋細菌54.41%的變化，第2主軸解釋1.17%的變化。主要環境因子對細菌變化解釋率大小依次為速效鉀含量（23.50%）>堿解氮含量（9.60%）>土壤有機質含量（8.60%）>土壤酸堿度（4.80%）。由圖8可知，Candidatus Solibacter、Rhodoplanes、Shannon指數與土壤有機質、速效鉀含量呈較強正相關關系，Rhodanobacter、Planctomyces分別與土壤交換性鈣、全氮含量呈較強正相關關系。由圖9可知，成熟期第1主軸解釋細菌57.87%的變化，第2主軸解釋2.99%的變化。主要環境因子對菌落變化的解釋率大小為土壤有機質含量（23.50%）>交換性鎂含量（10.50%）>有效磷含量（7.90%）>堿解氮含量（6.70%）。該時期Planctomyces與土壤有機質含量及土壤酸堿度呈較強正相關關系，Shannon指數與Simpson指數均與土壤堿解氮、速效鉀含量呈較強正相關關系;物種豐富度指數（Chaol指數）大小反映了物種種類多少，本研究中Chao1指數與土壤全氮、交換性鎂含量呈正相關關系。

2.4 不同綠肥翻壓處理對植煙地土壤致病菌與固氮菌的影響

烤煙之所以產生連作障礙，其主要原因是烤煙根部土壤中易產生致病菌，而固氮菌能夠固定空氣中氮氣產生養分，因此有必要調查不同處理后土壤中致病菌與固氮菌的豐度差異。本研究分析了青枯菌屬（Ralstonia）、短桿菌屬（Conexibacter）、柯克斯體屬（Aquicella）等3種致病菌豐度變化情況。由表3可知，Aquicella豐度較高，是主要致病菌;所有處理成熟期土壤中致病菌豐度均高于旺長期，尤其是

Ralstonia、Aquicella在成熟期除CK處理外土壤中均顯著增加，說明烤煙生長過程中根部土壤一直在聚集致病菌，但是同一時期內，翻壓綠肥的土壤致病菌大多顯著低于未翻壓綠肥的土壤，說明翻壓綠肥有助于降低植煙地土壤致病菌豐度，尤其是T3處理，在旺長期與成熟期均能顯著降低Ralstonia豐度。對土壤中苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、固氮螺菌屬（Inquilinus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等3個固氮菌屬的豐度變化研究發現，Phenylobacterium相對其他2種固氮菌豐度較高，屬于優勢固氮菌。且本研究表明，與對照相比，綠肥翻壓能顯著增加旺長期土壤固氮菌屬Phenylobacterium的豐度。旺長期T1處理土壤中Phenylobacterium豐度比CK處理提高了75.00%，成熟期T3處理土壤中Phenylobacterium豐度比CK提高了 92.31%，T2處理土壤中Phenylobacterium豐度在旺長期與成熟期分別比CK處理增加了62.50%、46.15%。由此可見，翻壓豆科綠肥植物有利于增加植煙土壤中Phenylobacterium豐度。

3 討論與結論

土壤微生物群落結構因土壤類型、作物種類、施用肥料的不同而有很大差異[18]，因此，本研究中除了翻壓的綠肥植物不同外，其他條件均控制一致，避免其對試驗結果造成干擾。本研究發現，翻壓綠肥植物可以提高土壤有機質、全氮、土壤速效養分含量，養分含量的提高在旺長期表現得更明顯，這與葉協鋒等的研究結果[19-21]類似。不同種類綠肥植物對不同養分含量的提高效果也不盡相同，本研究發現，T2處理有利于提高土壤有機質含量，T1、T3處理則更有利于增加土壤氮素含量。

綠肥翻壓后提供了大量碳源和氮源，使土壤細菌Shannon指數與Simpson指數明顯提高，這與楊昊等的研究結果[22]一致。本研究發現，土壤細菌Shannon指數在旺長期與有機質含量呈正相關關系，而在旺長期翻壓黑麥草處理的Shannon指數提高得最多，因此可以得出，有機質含量高的綠肥植物更有利于提高土壤細菌Shannon指數。

通過對土壤細菌屬分類水平的分析發現，綠肥翻壓后，旺長期Planctomyces豐度有很大提高，已有研究表明，Planctomyces是Planctomycetaceae下的1個屬，具有參與碳循環、富集礦物的功能[23]，這與本研究發現的Planctomyces與有機質、全氮、有效磷含量呈正相關關系的結果類似。

通常烤煙收獲之后，為防止烤煙根際土壤中致病菌對下茬作物的影響，煙農要將煙株連根挖起。對植煙地土壤中致病菌的調查發現，Ralstonia、Conexibacter、Aquicella等3種致病菌相對豐度較大，其中Ralstonia是煙草青枯病的主要病原菌[24]。本研究發現，翻壓綠肥的土壤中致病菌豐度均低于CK處理，其中T3處理對降低植煙地土壤致病菌的作用最明顯，這可能是由于綠肥翻壓為土壤其他類細菌提供了繁殖的條件，與致病菌產生拮抗作用。對固氮菌的豐度分析發現，T3處理土壤Phenylobacterium、Inquilinus、Cupriavidus等3種固氮菌豐度較對照均有顯著提高。土壤致病菌與固氮菌豐度的變化說明翻壓綠肥能夠改善植煙土壤細菌結構。

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