豬肺炎支原體纖毛黏附因子P97和F7-CTB對O型口蹄疫滅活疫苗的免疫增強作用

郭蕓蕓 張雪寒 劉茂軍

摘要：旨在研究豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，簡稱Mhp）纖毛黏附因子P97以及F7鞭毛蛋白（flagellin，簡稱F）-霍亂毒素B亞基（cholera toxin B subunit，簡稱CTB）2種重組蛋白對口蹄疫（foot-and-mouth disease，簡稱FMD）滅活疫苗的免疫增強作用。通過體外表達獲得pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1 2種重組蛋白，用間接酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）方法檢測pCold-F7-CTB蛋白的生物學活性，將重組蛋白分別與口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，簡稱FMDV）滅活抗原、口蹄疫滅活疫苗混合制備，皮下或腹腔接種Balb/c小鼠，共免疫2次，間隔3周。分別于免疫前、免疫后21、35、49 d采血，49 d后無菌摘取脾臟。采用阻斷ELISA的方法檢測小鼠血清口蹄疫O型病毒免疫球蛋白（IgG）抗體滴度，用流式細胞術檢測脾淋巴細胞亞型比例，以評估免疫效力。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）和蛋白質印跡法（Western Blot）分析結果表明，2種重組蛋白成功表達。用GMl（神經節苷脂）-ELISA方法驗證pCold-F7-CTB的生物學活性，發現融合蛋白F7-CTB保留了與GMl的結合能力。小鼠免疫試驗結果表明，經皮下注射接種后，單獨口蹄疫病毒滅活抗原組沒有產生明顯的抗體水平，而F7-CTB免疫增強劑組比單獨口蹄疫病毒滅活抗原組的IgG滴度更高。在試驗中發現，當重組蛋白與口蹄疫滅活疫苗聯合使用時，血清中的IgG滴度明顯增高，CD3+CD8+T淋巴細胞比值上升;P97和F7-CTB混合使用對口蹄疫滅活疫苗的免疫增強效果最佳。可以初步得出，免疫增強劑P97和F7-CTB具有協同作用，皮下注射可顯著提高FMD的特異性IgG水平，CD3+CD8+T淋巴細胞比值升高，顯示其具有良好的應用前景。

關鍵詞：口蹄疫;P97;F7-CTB;免疫增強劑

中圖分類號： S855.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0204-06

口蹄疫（foot and mouth disease，簡稱FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，簡稱FMDV）引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，被世界動物衛生組織（OIE）列為必須報告的傳染病之一[1]。疫苗接種是預防和控制口蹄疫最可靠和有效的手段[2]。目前滅活口蹄疫疫苗的使用仍最為廣泛[3-4]。現有的口蹄疫疫苗存在免疫后抗體產生慢、抗體水平低和持續期短的缺點[5]，因此，本研究以增強免疫效力為目的，嘗試研制一種新型免疫增強劑。

結合豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，簡稱Mhp）的免疫學特點，R1區作為Mhp纖毛黏附因子p97黏附纖毛的主要決定區，主要引起黏膜免疫和細胞免疫[6]。同時也是少數被證明具備免疫保護能力的抗原之一[7-8]。鞭毛蛋白作為 TLR-5受體激動劑，能誘導強烈、廣泛的免疫反應[9]。

鞭毛蛋白（flagellin，簡稱F）佐劑的效果在流感病毒[10-11]、結核分枝桿菌[12]和鼠疫菌[13]的研究中已經被多次確認，鞭毛蛋白是較好的載體及佐劑。Albert等在研制亞單位疫苗時，將結腸彎曲菌的鞭毛蛋白的FlaA片段與麥芽糖結合蛋白（maltose-binding protein，簡稱MBP）進行融合表達，得到了MBP-F1aA重組蛋白，通過口服途徑免疫，結果顯示，對照組小鼠腸道的細菌完全定植，MBP-F1aA免疫組有71.4%的小鼠有細菌定植，顯示該重組蛋白在一定程度上抵御了結腸彎曲菌的感染[14]。Delaney等用flagellin-L1R（FR）重組蛋白（將牛痘病毒L1R抗原序列連到細菌鞭毛蛋白N端）免疫小鼠，結果能產生與天然L1R相互作用的抗體，FR重組蛋白更能促進抗原特異免疫球蛋白（IgG）的產生，加強免疫后可產生有效的保護性免疫應答，對小鼠能提供100%的保護[15]。大腸桿菌霍亂毒素（CT）具有黏膜免疫佐劑活性，是細菌類毒素，研究發現，CT的B亞單位單獨作用，表現為無毒性，但仍可保持較強的佐劑活性，能刺激機體產生強烈的黏膜系統免疫應答，調節Th1、Th2型細胞反應的細胞因子的表達[16]。Hou等將霍亂毒素B亞基（cholera toxin B subunit，簡稱CTB）作為黏膜佐劑，與HIV-1DNA（人免疫缺陷病毒-1的DNA）疫苗聯合后免疫小鼠，可誘導其產生高水平的Thl和Th2型細胞因子、炎癥細胞因子和趨化因子，同時提高血清中Env蛋白的IgG抗體水平[17]。Miyata等將CTB與蛋白MSP1-19耦合，可以提高血清和支氣管肺泡灌洗液中的IgG抗體水平[18]。由以上結果可以看出，CTB無論是作為黏膜免疫佐劑還是抗原遞送載體，都有良好的免疫增強作用。本研究將F7和CTB基因進行連接后重組表達，并與P97重組蛋白聯合或分別單獨作用，從體液免疫及細胞免疫角度來評估其免疫應答，以期改善傳統疫苗的缺點。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

PCold Ⅰ-F7、pUC57-CTB質粒均由由農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室保存;pET32a-P97-R1由江蘇省農業科學院獸醫研究所豬病研究室惠贈;大腸桿菌感受態細胞Trans5α和BL21（DE3），購自TransGen公司。

1.2 主要試劑

限制性核酸內切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、Sal Ⅰ、Xba Ⅰ和T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司;蛋白純化試劑盒，購自GE公司;辣根過氧化物酶（HRP）-小鼠抗組氨酸（histidine，簡稱His）標簽、HRP-羊抗鼠-IgG和HRP-羊抗兔-IgG，購自博士德生物工程有限公司;CTB蛋白、兔源抗大腸桿菌不耐熱性腸毒素（Heat-labile enterotoxin B subunit，簡稱LTB）抗體、神經節苷脂1（Ganglioside，簡稱GM1）和胎牛血清，購自Sigma公司;PE-CyTM7 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti -Mouse CD4和FITC Rat Anti-Mouse CD8a，購自美國BD公司;單組分3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（3，3′，5，5′-Tetra-methylbenzidine，簡稱TMB）顯色液Ⅰ、無血清培養基RPM 1640、Triton x-114，購自南京助研生物技術有限公司;MONTANIDE ISA 206 VG，購自賽彼科（上海）特殊化學品有限公司;內毒素檢測試劑盒，購自Thermo公司;口蹄疫O型液相阻斷酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）抗體檢測試劑盒，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.3 試驗動物

6周齡Balb/c小鼠，購于揚州大學醫學院。

1.4 pCold I-F7-CTB重組質粒的構建

將筆者所在實驗室保存的克隆質粒pUC57-CTB用限制性內切酶Sal Ⅰ、Xba Ⅰ酶切，獲得目的基因CTB，將其插入到表達載體pCold I-F7相應的酶切位點中，構建重組質粒pCold I-F7-CTB。

1.5 重組菌的構建

將重組質粒pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1轉化大腸桿菌BL21（DE3），涂布于LB平板（含100 μg/mL氨芐青霉素）上。過夜培養，挑取單菌落，酶切鑒定，獲得重組菌株pCold I-F7-CTB/BL21（DE3）和pET32a-P97-R1/BL21（DE3）。

1.6 重組蛋白的表達

1.6.1 重組菌的誘導表達 將上述重組菌于37 ℃繼續快速培養至D600 nm=0.4～0.6，加異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，簡稱IPTG）至終濃度為1 mmol/L（同時設空載體對照組）;將pCold I-F7-CTB/BL21菌株于 16 ℃、18～24 h誘導表達，并將pET32a-P97-R1/BL21菌株于37 ℃、5 h誘導表達，收集細菌。

1.6.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）鑒定重組蛋白質的表達 各取3 mL上述誘導培養物，于12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用1/10體積的 0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（簡稱PBS，pH值為7.4）重懸菌體，在冰水浴中超聲裂解至菌體全部破碎，取部分超聲裂解菌體作為全菌蛋白質，將剩余部分離心分離菌體上清液和沉淀。通過SDS-PAGE分別檢測全菌、上清液和沉淀，分析重組蛋白的表達形式。

1.7 重組蛋白的純化和蛋白質印跡法（Western Blot）分析

對于2種誘導重組菌pCold I-F7-CTB/BL21（DE3）和pET32a-P97-R1/BL21（DE3），參照GE公司的His TrapTM HP說明書，對上清液進行純化。用SDS-PAGE分析純化效果，同時用純化后的蛋白進行Western Blot分析，通過RC DC Protein Assay檢測純化蛋白的濃度，并用Triton X-114法去內毒素，用顯色法檢測內毒素含量，具體操作參照使用說明書。

1.8 GM1-酶聯免疫吸附

用100 μL pH值為9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（含2 μg神經節苷脂GM1）包被96孔酶聯板，于4 ℃過夜;用 200 μL/孔 的2%牛血清白蛋白（BSA）于37 ℃封閉2 h;每孔加入12.5 ng pCold-F7-CTB蛋白，同時設陰、陽性對照，于37 ℃孵育2 h;加入以1 ∶ 1 000體積比稀釋的兔源抗LTB，于37 ℃孵育2 h;加入以1 ∶ 1 000體積比稀釋的HRP-羊抗 兔-IgG，于37 ℃孵育1 h;用3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色;加入終止液，測定D450 nm。

1.9 小鼠免疫接種

1.9.1 免疫試驗1 將6周齡的Balb/c小鼠隨機分成4組，5只/組，皮下注射配制的液體試劑，每只注射0.1 mL。配制方法：按照5 μg/只的蛋白量與口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，簡稱FMDV）滅活抗原混合制備，具體分組和免疫劑量見表1。共免疫2次，間隔3周。分別于免疫前與免疫后21、35、49 d在小鼠眼眶靜脈叢采血，測定抗體水平。

1.9.2 免疫試驗2 將6周齡的Balb/c小鼠隨機分成8組，5只/組，按照5 μg/只的蛋白量與FMDV滅活抗原混合后，再按1 ∶ 1的比例添加MONTANIDE ISA 206 VG制備口蹄疫滅活疫苗。比較P97、F7-CTB 2種重組蛋白單獨添加以及混合添加對口蹄疫滅活疫苗的免疫增強作用，同時比較皮下、腹腔2種免疫途徑的差異。具體分組和免疫劑量見表2。共免疫2次，間隔3周。分別于免疫前、免疫后21、35、49 d在小鼠眼眶靜脈叢采血，測定抗體水平。

1.10 血清中口蹄疫O型病毒抗體IgG的檢測

用口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒進行檢測，分別于免疫前與免疫后21、35、49 d采集血液，分離血清，檢測方法參照具體說明書。

1.11 流式細胞術檢測脾淋巴細胞CD3+、CD4+和CD8+亞型比例于首免 49 d 時，取 1×106/mL 小鼠脾臟淋巴細胞加入1.5 mL 無菌離心管中，用1 mL 0.01 mol/L PBS，于1 500 r/min離心5 min，棄去上清，用溶有PE-CyTM7 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti-Mouse CD4和FITC Rat Anti-Mouse CD8a熒光抗體的300 μL熒光洗液[100 mL，0.01 mol/L PBS，pH值為7.4，用2% N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）]重懸細胞，充分混勻后于4 ℃避光孵育30 min，用 0.01 mol/L PBS洗滌2次，每次1 mL，于1 500 r/min離心 5 min，棄上清，將管底細胞用500 μL熒光保存液（100 mL，0.01 mol/L PBS，pH值為7.4，2%葡萄糖，0.1% NaN3）重懸，利用流式細胞儀（BD AccuriTM C6 Plus）檢測10 000個細胞中CD3+、CD4+和CD8+陽性細胞數。