3種柴胡染色體數(shù)目測(cè)定及基因組大小估測(cè)

都明理 徐嬌 朱楚然

摘要：鏡檢北柴胡、狹葉柴胡、三島柴胡染色體數(shù)目，利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定基因組大小，為柴胡基因組測(cè)序奠定基礎(chǔ)。采用常規(guī)壓片及顯微鏡方法觀測(cè)柴胡體細(xì)胞染色體數(shù)目，以柴胡嫩葉為材料，采用LB01解離液和碘化丙啶熒光染料，利用基因組大小已知的番茄（H-1706、潘那利）作為內(nèi)標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其基因組大小進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，北柴胡、三島柴胡體細(xì)胞染色體數(shù)目分別為12、26條，基因組大小估測(cè)分別為989.80 Mb和2.14 Gb;狹葉柴胡群體內(nèi)存在2種類型：一種類型的葉片窄，成熟植株的根外皮為棕紅色，染色體數(shù)為12條;另一種葉片較寬，成熟植株的根外皮為淺黃色，染色體數(shù)為26條，基因組大小估測(cè)分別為782.50 Mb和1.92 Gb。3種柴胡的染色體數(shù)目確定和基因組大小估測(cè)可為柴胡全基因組測(cè)序和細(xì)胞學(xué)等研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柴胡;流式細(xì)胞技術(shù);基因組大小;染色體數(shù)目

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0191-03

柴胡是多年生草本植物，以干燥根入藥，是我國常用的大宗中藥材之一，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣等功效。《中華人民共和國藥典》2015版一部規(guī)定，柴胡正品藥材為傘形科植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）和狹葉柴胡（B. scorzonerifolium Willd.）的干燥根[1]。三島柴胡（B. falcatum L.）為日本藥用柴胡栽培品種，在我國也有種植[2]。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多藥用植物的全基因組完成了測(cè)序[3-5]。藥用植物全基因組信息的明確將快速推動(dòng)其分子水平相關(guān)研究的深入開展，有助于人們了解和利用其遺傳及代謝機(jī)制。全基因組測(cè)序前通常需確定染色體數(shù)目，預(yù)估基因組大小。目前進(jìn)行基因組大小評(píng)估的主要方法包括孚耳根微顯影法[6]、流式細(xì)胞術(shù)[7]以及Survey測(cè)序法[8]。流式細(xì)胞術(shù)具有操作簡單和分辨率、準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于測(cè)定不同物種（如黃芩[9]、巴戟天[10]、靈芝[11]等）基因組大小的研究中。

柴胡屬植物體態(tài)呈禾草狀，形態(tài)變異大，花、果結(jié)構(gòu)相對(duì)來說變異較小，但其種類劃分仍是植物分類鑒定方面的難點(diǎn)之一。同時(shí)，柴胡屬是一個(gè)染色體多基數(shù)的屬，基數(shù)以6、7、8常見[12]。姜傳明等對(duì)黑龍江省及東北柴胡屬的研究發(fā)現(xiàn)，三島柴胡為二倍體，2n=20或2n=26;北柴胡染色體數(shù)目為 2n=12 或2n=24，推測(cè)其可能為四倍體;狹葉柴胡為二倍體，染色體數(shù)目為2n=12[13-14]。郭麗華的研究表明，北柴胡、三島柴胡、狹葉柴胡染色體數(shù)目分別為2n=24、2n=26、2n=12[15]。劉宏偉在對(duì)北柴胡品種川北柴1號(hào)的染色體鏡檢中發(fā)現(xiàn)，其染色體數(shù)目為2n=12[16]。邵天玉在對(duì)北柴胡和狹葉柴胡的染色體進(jìn)行比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，北柴胡和狹葉柴胡的染色體數(shù)目分別為2n=18和2n=8[17]。可見同一種柴胡的染色體數(shù)目也存在很大變化。柴胡屬不同種基因組大小預(yù)測(cè)可見報(bào)道的有6個(gè)種，包括三島柴胡，為2.72 Gb，不包括北柴胡和狹葉柴胡[18-19]。本研究鏡檢擬進(jìn)行基因組測(cè)序的柴胡樣品染色體數(shù)目，并預(yù)測(cè)基因組大小，旨在為柴胡全基因組測(cè)序奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北柴胡選擇中柴2號(hào)品種，狹葉柴胡選擇黑龍江省明水縣種植品種，三島柴胡選擇河北安國種植品種。從各產(chǎn)區(qū)種植點(diǎn)收集種子，統(tǒng)一種植于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所栽培育種試驗(yàn)基地。基因組大小估測(cè)試驗(yàn)中作為內(nèi)標(biāo)（對(duì)照）的番茄為Solanum lycopersicon（H-1706番茄，基因組大小為950 Mb）和S. pennellii（潘那利番茄，基因組大小為 1.25 Gb）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體數(shù)目測(cè)定 柴胡種子萌發(fā)后，待根長至 0.5 cm 時(shí)取根尖，置于飽和對(duì)二氯苯和α-溴代萘水溶液中，在4 ℃冰箱中預(yù)處理12 h后，用甲醇與冰醋酸（V甲醇 ∶ V冰醋酸=3 ∶ 1）固定1 h以上，1 mol/L鹽酸45 ℃處理45 min，蒸餾水沖洗，然后用卡寶品紅染色，常規(guī)壓片，顯微鏡觀察并選取分散良好的分裂相照相。

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定柴胡基因組大小

1.2.2.1 細(xì)胞核懸液的制備與DNA特異性染色 采集柴胡樣品的新鮮葉片組織，每個(gè)樣品取20～50 mg，分別置于加入1 mL LB01解離液（配方見表1）的培養(yǎng)皿中，并迅速用鋒利的刀片將其快速切碎。溫和地吸取培養(yǎng)皿中的解離液過濾至1.5 mL 的EP管中，加入100 μL碘化丙啶熒光染料，置于 4 ℃ 冰箱中避光染色10 min，隨即上機(jī)檢測(cè)。對(duì)照樣品的處理方法同上，并將待測(cè)樣品與對(duì)照樣品進(jìn)行混合制樣（細(xì)胞核懸液進(jìn)行等比例混勻），每個(gè)上機(jī)樣品中有3 000～5 000個(gè)細(xì)胞核。

1.2.2.2 基因組大小測(cè)定及計(jì)算 上機(jī)前將樣品振蕩5 s，采用488 nm的藍(lán)光激發(fā)，收集625/26通道的熒光，檢測(cè)PI發(fā)射的熒光強(qiáng)度以確定DNA相對(duì)含量;再通過流式細(xì)胞儀自帶的軟件Summit 5.2分析數(shù)據(jù)并進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析。基因組大小計(jì)算方法：待測(cè)樣本基因組大小=對(duì)照樣本基因組大小×[（待測(cè)樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度）/（對(duì)照樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度）]，其中G0/G1表示處于G0和G1細(xì)胞分裂期的細(xì)胞數(shù)量比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目測(cè)定

采用傳統(tǒng)的根尖染色體制片法進(jìn)行鏡檢，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，北柴胡品種中柴2號(hào)和三島柴胡的體細(xì)胞染色體數(shù)目分別為12、26條;狹葉柴胡存在2種類型，一種類型葉片窄，成熟植株的根外皮為棕紅色，體細(xì)胞染色體數(shù)為12條，另一種類型葉片寬，成熟植株的根外皮為淺黃色，體細(xì)胞染色體數(shù)為26條。

2.2 基因組大小的測(cè)定

以2種番茄（H-1706番茄和潘那利番茄）為內(nèi)標(biāo)，分別測(cè)定4個(gè)柴胡樣品的基因組大小，測(cè)定樣品和內(nèi)標(biāo)混合后的PI發(fā)射熒光強(qiáng)度，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，峰P1和P2分別為番茄內(nèi)標(biāo)和柴胡樣品的熒光峰，可見兩者分度較好，無重疊現(xiàn)象。根據(jù)“1.2.2.2”節(jié)中的公式計(jì)算得到，北柴胡、三島柴胡基因組大小分別為989.80 Mb、2.14 Gb;狹葉柴胡群體中2種類型植株，窄葉紅根類型的基因組大小為782.50 Mb，寬葉淺黃根類型的基因組大小為1.92 Gb（表2）。

3 結(jié)論與討論

染色體有種屬特異性，不同地區(qū)居群所產(chǎn)生的形態(tài)變異與它們的染色體數(shù)和核型變異相聯(lián)系，因此染色體變異可較為直接地反映物種在環(huán)境條件作用下的遺傳變異性，染色體資料是從本質(zhì)上探討分類和進(jìn)化的有效資料之一。柴胡屬不同種染色體數(shù)目變化較大，存在多種基數(shù)，同一種內(nèi)也存在不同基數(shù)和不同倍性現(xiàn)象。基數(shù)x為4，是傘形科中發(fā)現(xiàn)的最低染色體基數(shù)。北柴胡已報(bào)道的基數(shù)有x=6和x=10，已報(bào)道的北柴胡多倍體類型有四倍體2n=4x=24和八倍體2n=8x=48[12]，本研究測(cè)定的北柴胡樣品染色體數(shù)目為2n=12，應(yīng)為基數(shù)x=6的二倍體。三島柴胡染色體數(shù)目同樣存在不同情況的報(bào)道，本研究測(cè)得26條染色體，是報(bào)道中較常見的類型，結(jié)合以往報(bào)道，三島柴胡樣品應(yīng)為基數(shù)x=13的二倍體。狹葉柴胡樣品中存在2種類型，其中窄葉類型根外皮為棕紅色，應(yīng)為真正的狹葉柴胡，染色體數(shù)目為2n=12，也是較常見的類型;寬葉類型根外皮為淺黃色，可能是種植過程中混合了其他柴胡種質(zhì)。

借助流式細(xì)胞儀來測(cè)定植物基因組大小具有簡單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，所以應(yīng)用得越來越廣泛。但在實(shí)際的測(cè)定過程中，提取液、提取材料、內(nèi)標(biāo)植物的選擇均可能對(duì)其基因組大小估測(cè)的準(zhǔn)確性有一定影響。筆者后期又利用二代高通量測(cè)序技術(shù)（Illumina Hiseq 2000）測(cè)定了北柴胡、狹葉柴胡（窄葉紅根類型）和三島柴胡的基因組大小，測(cè)序數(shù)據(jù)采用 Kmer=17進(jìn)行分析，預(yù)估3種柴胡基因組大小分別為 1.03 Gb、746.52 Mb和2.08 Gb（待發(fā)表），該結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的結(jié)果基本相符，表明流式測(cè)定結(jié)果可靠，而以往報(bào)道預(yù)測(cè)的三島柴胡基因組大小為2.72 Gb[18]，可能是由于材料的差異或是試驗(yàn)過程的差異。

致謝：感謝中國科學(xué)院植物研究所公共技術(shù)服務(wù)中心提供的流式細(xì)胞技術(shù)，感謝中國科學(xué)院植物研究所公共技術(shù)服務(wù)中心的楊素華工程師在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定柴胡基因組大小試驗(yàn)中提供的幫助。

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