鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內的藥代動力學及殘留消除規(guī)律

余琳雪 劉永濤 丁 浩 蘇志俊 艾曉輝

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430223; 2. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306;3. 農業(yè)部水產品質量安全控制重點實驗室, 北京 100125)

鹽酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride, ROBH)是一種人工合成的抗球蟲藥[1], 相對分子量為370.66, 分子式為C15H13Cl2N5·HCl, 屬胍基衍生物[2]。在水產養(yǎng)殖中, 鹽酸氯苯胍是我國允許使用的國標漁藥, 主要用于治療魚類孢子蟲病[3]。近年來, 由于藥物殘留問題帶來的經濟損失越來越多, 水產藥物在使用過程中也不可避免會帶來藥物殘留問題, 目前水產品漁藥殘留問題已經成為制約我國水產品出口的主要問題。藥物使用不當或使用過量都會引起水產品藥物殘留問題, 水產品中的藥物殘留會危害水產品的質量安全, 人們長期食用這些帶漁藥殘留的水產品會嚴重危害身體健康, 同時也會對自然環(huán)境造成污染, 污染水域環(huán)境, 影響水生動物的正常生長。目前, 水產品中藥物殘留的檢測技術主要有高效液相色譜[4—6]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術[7,8]和免疫分析法[9,10]。通過對藥物殘留的檢測, 可以制定藥物的最高殘留限量以及休藥期等參數, 確保水產品的質量安全。目前, 關于鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)體內的藥代動力學及殘留消除規(guī)律的研究尚未見報道。

本試驗以斑點叉尾鮰作為研究對象, 研究鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰體內的藥代動力學及殘留消除規(guī)律, 制定試驗條件下藥物的休藥期, 保證用藥安全, 旨在為水產品的質量安全問題提供理論依據,確保水產動物的食用安全性, 保障人們的生命健康。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

斑點叉尾鮰, 平均體重(200±50) g, 購自中國水產科學研究院長江水產研究所基地, 在運至實驗室后, 放置于已清洗并用高錳酸鉀消毒的水族箱(122 cm×80 cm×80 cm)中暫養(yǎng)1周, 試驗用水為充分曝氣的自來水。在暫養(yǎng)結束后, 選擇無病無傷, 規(guī)格均勻的個體, 控制水溫為(28±1)℃, 自然光照, 連續(xù)24h充氣; 每2天換1次水, 每次換水量1/3; 及時清除水體殘餌和排泄物。

1.2 儀器與試劑

Mettler-TOLE-DOAE-240型精密電子天平(梅特勒-托利多公司)、20PR-520型高速冷凍離心機(日本日立)、調速混勻器(上海康華)、氮吹儀(AOSHENG, 杭州奧盛儀器有限公司)、高效液相色譜—串聯(lián)質譜(Suryeyor MS Pump Plus, Suryeyor Autosampler Plus, Thermo TSQ Quantum Acess MAX)及Thermo LCquan 2.6 數據采集處理軟件。

鹽酸氯苯胍(純度≥98%, 質量比, 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、鹽酸氯苯胍-D8標準品(純度≥98%, 質量比, 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)、鹽酸氯苯胍原料藥(CAS 25875-50-7, 純度98%, 壽光市華弛化工有限公司)。乙腈、乙酸、乙酸乙酯、正己烷、甲酸(色譜純, 美國J.T. Baker公司)。無水乙醇(分析純, 西隴化工股份有限公司)、蒸餾水, 可溶性淀粉(分析純, 湘中化學試劑供應站)、無水硫酸鎂(分析純, 國藥集團化學試劑有限公司)、肝素鈉(生物級, 上海生化試劑有限公司)。

1.3 給藥及樣品采集

藥代動力學試驗: 鹽酸氯苯按胍20 mg/kg劑量口灌斑點叉尾鮰, 分別于給藥后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h自尾靜脈采血樣, 每個時間點采樣5尾, 從尾靜脈采集血液樣品, 裝于用肝素鈉溶液潤洗的離心管中, 4000 r/min離心5min, 取上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

殘留消除規(guī)律試驗: 按20 mg/kg劑量連續(xù)5d口灌給藥, 分別在最后一次給藥后1d、2d、3d、5d、7d、9d、12d、15d、20d、25d和30d采樣, 采樣方法同藥代組。

1.4 樣品處理

將樣品在室溫下解凍后, 取1 mL血漿或適量組織(肌肉2 g, 其他組織各1 g)于15 mL離心管中, 加入50 μL, 1 μg/mL內標溶液氘代鹽酸氯苯胍, 加入7 mL1%甲酸乙酸乙酯溶液, 置調速混勻器上渦旋振蕩30s, 超聲5min, 再加入0.5 g無水硫酸鎂, 渦旋振蕩30s, 8000 r/min離心5min, 轉移上清液至新的離心管中, 再重復上述操作提取一次, 合并2次上清液于離心管中, 置45℃氮吹儀上氮吹至干, 用1 mL定容溶液(0.1%甲酸水溶液∶甲醇=30∶70)溶解殘渣,渦旋振蕩30s, 12000 r/min離心5min, 0.22 μm微孔濾膜過濾后上機檢測。

1.5 儀器條件

色譜柱: Symmetry?C18(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)色譜柱; 流速為250 μL/min; 進樣量20.0 μL;柱溫: 30℃。

質譜條件: 采用加熱電噴霧離子源(HESI), 負離子模式; 檢測方式采用選擇反應監(jiān)測(SRM)模式;噴霧電壓: -3000 V; 鞘氣壓力40 kPa; 輔助氣壓力5 kPa; 蒸發(fā)氣溫度: 350℃; 碰撞氣及壓力: 氬氣,1.5 MPa; 離子傳輸毛細管溫度: 350℃。母離子, 定性離子對, 定量離子對和碰撞能量(表 1)。

表 1 鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍質譜條件Tab. 1 Mass spectrometry parameters of ROBH and ROBH-D8

1.6 標準曲線的制備及回收率與精密度測定

標準儲備液的制備: 分別準確稱取10 mg的鹽酸氯苯胍標準品和氘代鹽酸氯苯胍標準品, 置于100 mL的容量瓶中, 分別加少量甲醇溶解并定容至100 mL, 配制成質量濃度均為100 mg/L的鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍標準儲備液, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標準曲線的制備: 以標準儲備液為基礎, 配制含氘代鹽酸氯苯胍內標50 ng/mL, 鹽酸氯苯胍濃度為0.01、0.05、0.2、0.5、2、5、10和20 μg/mL的標準曲線, 作HPLC-MS分析; 以測得的鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍的峰面積比值為縱坐標, 鹽酸氯苯胍的濃度為橫坐標, 計算回歸方程和相關系數。

回收率與精密度測定: 在空白組織中分別添加3個濃度水平的標準溶液, 使組織中鹽酸氯苯胍質量濃度分別為1、10和100 ng/mL, 氘代鹽酸氯苯胍的質量濃度為50 ng/mL。每個濃度的樣品5個平行,計算回收率及精密度。

1.7 數據處理

標準曲線, 消除曲線方程采用Microsoft Excel 2013軟件繪制, 藥物動力學模型擬合及參數計算采用中國藥理學會數學專業(yè)委員會編制的3p97藥代動力學程序軟件處理。

2 結果

2.1 標準曲線及回收率

在1—20 μg/mL濃度內鹽酸氯苯胍線性關系良好, 線性方程為y=0.0107x+0.0191, 相關指數R2=0.9991。

在本試驗建立的色譜條件下, 基線走動平穩(wěn),鹽酸氯苯胍峰形良好, 無明顯雜質峰影響。鹽酸氯苯胍的出峰時間為約5.22min, 氘代鹽酸氯苯胍的出峰時間約為5.21min, 樣品的分析時間為9min。并通過內標法來對各時間點的組織藥物含量進行測定。

2.2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內各組織中的藥時曲線

由圖 1可見, 在各組織中的藥物濃度均出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象, 且2次的達峰時間均為8h和24h, 鹽酸氯苯胍在血漿中的峰濃度值較其他組織高。

表 2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾各組織中的平均加標回收率和精密度Tab. 2 The average recoveries and precisions for ROBH in the Ictalurus punctatus tissues (n=5)

表 2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾各組織中的平均加標回收率和精密度Tab. 2 The average recoveries and precisions for ROBH in the Ictalurus punctatus tissues (n=5)

10 (ng/mL或μg/kg)組織Tissue 1 (ng/mL或μg/kg)100 (ng/mL或μg/kg)血漿Plasma 89.43±2.88 88.07±2.57 95.22±1.51肌肉Muscle 96.50±3.00 107.71±4.26 78.47±2.82皮膚Skin 82.71±3.31 95.89±3.38 98.69±1.92肝Liver 64.02±3.53 81.08±3.05 76.50±1.95腎Kidney 114.17±4.19 91.19±2.66 95.92±3.94鰓Gill 73.92±2.34 81.43±4.52 96.31±4.33腦Brain 81.48±0.05 82.05±1.58 79.72±0.25腸Intestines 77.75±5.35 98.26±2.64 90.27±2.62

圖 1 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的藥時曲線Fig. 1 The concentration-time curve of ROBH in tissues of Ictalurus punctatush (n=5)

2.3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的藥動學參數

2.4 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內的殘留消除規(guī)律

由表 4可見, 鹽酸氯苯胍在腸道中的殘留量最大, 在血漿中的殘留量最低。消除半衰期在各組織中的大小依次為: 腸＞皮膚＞腎臟＞肝臟＞肌肉＞腦＞鰓＞血漿, 說明鹽酸氯苯胍在腸道中消除最慢, 在血漿中消除最快。

2.5 休藥期(WDT)的確定

3 討論

3.1 藥時曲線的雙峰現(xiàn)象

斑點叉尾鮰按20 mg/kg單劑量口灌鹽酸氯苯胍后, 由圖 1可以看出鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的藥-時曲線均出現(xiàn)了明顯的雙峰現(xiàn)象。目前, 關于口服藥物藥-時曲線的雙峰現(xiàn)象報道較多[11—14],主要有以下幾種解釋: 肝腸循環(huán), 指藥物經膽汁排入十二指腸后, 部分藥物可再經小腸上皮細胞被重新吸收返回肝臟, 從而引起雙峰現(xiàn)象的出現(xiàn); 雙部位吸收, 指口服藥物在胃腸兩個不同部位吸收時, 有快有慢, 因而出現(xiàn)雙峰; 胃排空, 由于胃在一定的時間會進行排空, 因而導致藥物進入小腸的時間不同, 造成藥物2次入血, 出現(xiàn)雙峰。而脂溶性藥物在口服吸收后, 迅速分布到組織中, 在血液中藥物代謝到一定程度后, 也會出現(xiàn)二次釋放入血, 出現(xiàn)雙峰。此外, 雙峰現(xiàn)象還可能與藥物的分布、重吸收有關, 即當其他組織的藥物濃度高于血漿藥物濃度時, 藥物可能會轉移到血中, 引起血藥濃度的再次升高[15]。

表 3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的主要藥代動力學參數Tab. 3 The pharmacokinetic parameters of ROBH in tissues of Ictalurus punctatush

表 3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的主要藥代動力學參數Tab. 3 The pharmacokinetic parameters of ROBH in tissues of Ictalurus punctatush

注: A為分布相的零時截距; α為分布速率常數; B為消除相的零時截距; β為消除速率常數; Ka為吸收速率常數; T1/2為消除半衰期;Tpeak為達峰時間; Cmax為峰濃度; AUC為藥時曲線下面積; CL為總清除率; V/F為相對表觀容積Note: A. Zero intercept of distribution phase; α. Distribution rate constant; B. Zero intercept of phase elimination; β. Elimination rate constant; Ka. Absorption rate constant; T1/2. Elimination half-life; Tpeak. The time at highest peak of concentration; Cmax. The biggest concentration of the drug in plasma; AUC. Area under concentration-time curve; CL. The overall clearance rate; V/F. Apparent volume of distribution

參數Parameters 單位Unit 血漿Plasma 肌肉Muscle 皮Skin 鰓Gill 肝臟Liver 腎臟Kidney Aμg/mL 7.69 - - - - -Bμg/mL 0.13 - - - - -α 1/h 0.02 - - - - -β 1/h 0.01 - - - - -ka 1/h 0.27 - - - - -T1/2 h 58.63 23.57 35.37 19.74 29.34 43.30 T(peak) h 10.03 15.79 11.10 2.61 12.89 7.87 Cmax mg/kg或μg/mL 5.76 2.91 2.90 3.05 3.04 0.42 AUC (mg/kg)/h或(μg/mL)/h 326.74 157.58 183.72 95.09 174.82 29.85 CL L/(h·kg) 0.06 0.13 0.11 0.21 0.11 0.67 V/F(c) L/kg 2.78 4.32 5.55 5.99 4.84 41.85

表 4 斑點叉尾口灌鹽酸氯苯胍后組織中的消除曲線方程及參數Tab. 4 The equation of elimination curve and parameters in tissues of Ictalurus punctatus after oral administration of ROBH

表 4 斑點叉尾口灌鹽酸氯苯胍后組織中的消除曲線方程及參數Tab. 4 The equation of elimination curve and parameters in tissues of Ictalurus punctatus after oral administration of ROBH

組織Tissue消除方程Equation相關系數Correlation coefficient (R2)消除半衰期(T1/2)Elimination half-life (d)血漿Plasma C血=612.53e-0.416t 0.9387 1.66肌肉Muscle C肌肉=504.46e-0.268t 0.9233 2.58 Liver C肝=1127.6e-0.19t 0.9552 3.65肝 腎Kidney C腎=1086.1e-0.168t 0.9664 4.12皮Skin C皮=2099.6e-0.235t 0.9628 2.95鰓Gill C鰓=4149.2e-0.31t 0.9585 2.24腸Intestines C腸=15060e-0.13t 0.9562 5.33腦Brain C腦=3257.1e-0.273t 0.9537 2.54

3.2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內藥動學特征

將鹽酸氯苯胍以20 mg/kg劑量單次口灌斑點叉尾鮰后, 通過3p97軟件分析, 可知鹽酸氯苯胍主要分布于斑點叉尾鮰的皮、肌肉和肝臟組織中, 藥物在腎臟中駐留時間最長。湯菊芬等[16]在紅笛鯛口灌鹽酸氯苯胍后, 發(fā)現(xiàn)藥物主要分布于腎臟和肝臟,在肌肉中平均駐留時間最長, 消除半衰期明顯高于腎臟和肝臟; 在眼斑擬石首魚[17]中, 鹽酸氯苯胍主要分布在腎臟中, 藥物在肝臟中的平均駐留時間最長, 其消除半衰期也高于腎臟和肌肉。可見藥物在體內的分布情況和代謝速率與作用對象密切相關。

3.3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內的殘留消除規(guī)律

將鹽酸氯苯胍以20 mg/kg的劑量連續(xù)口灌斑點叉尾鮰5d后, 第1天藥物在腸道內的殘留量遠高于其他組織, 濃度高達16.44 mg/kg, 而在其他組織中的藥物殘留濃度依次為: C鰓＞C腦＞C皮膚＞C肝＞C腎＞C血漿＞C肌肉, 說明鹽酸氯苯胍進入體內后, 優(yōu)先分布在腸、鰓、腦、皮膚等組織。而魚類孢子蟲病主要就是寄生在這些部位中, 這就促進了藥物療效的發(fā)揮, 但由于消除速率相對較快, 不會在腦中長時間殘留, 既能充分發(fā)揮藥物作用, 又可降低對腦神經的損傷。其在肌肉中的殘留量最低且消除速率較快, 在腸道中的消除最慢。班付國等[18]研究了雞組織中的氯苯胍的殘留消除規(guī)律, 結果顯示, 氯苯胍在肌肉中的殘留量最低且消除速度最快。李強[19]在對兔體內氯苯胍殘留消除規(guī)律進行了研究, 結果表明, 氯苯胍在兔的肝臟中藥物殘留量最高, 在肌肉和腎臟中殘留極少, 消除迅速, 在停喂3d后就檢測不到了。這與本文的研究結果基本一致, 但鹽酸氯苯胍在鮰體內的消除速率比在雞、兔體內較為緩慢, 這可能是因為不同研究對象對藥物的代謝速率不同。

3.4 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內的休藥期

目前, 關于鹽酸氯苯胍在可食動物產品中的最高殘留限量在國內外都有相關的規(guī)定。我國農業(yè)部于2002年發(fā)布第235號公告, 規(guī)定氯苯胍在雞脂肪、皮、可食組織中的最高殘留限量分別為200、200和100 μg/kg[20]。2012年, 美國《聯(lián)邦規(guī)章典集》中的關于鹽酸氯苯胍在雞脂肪、皮及其他可食用組織中的最高殘留限量規(guī)定與我國相同[21]。加拿大規(guī)定鹽酸氯苯胍在雞、兔子、火雞肌肉中的最大殘留限量均為100 μg/kg[22]。而關于水產品中鹽酸氯苯胍的最大殘留限量尚無明確規(guī)定[23]。根據日本2006年實施的食品中農業(yè)化學品殘留“肯定列表制度”, 要求對于未制定最大殘留限量標準的農業(yè)化學品在食品中含量不得超過10 μg/kg[24]。本研究將10 μg/kg作為鹽酸氯苯胍的最高殘留限量, 在肌肉組織中在第12天后含量為8 μg/kg, 低于最高殘留限量, 而本試驗對魚皮中藥物殘留量也進行了測定, 在第20天后魚皮的濃度為9 μg/kg, 低于最高殘留限量。而通過休藥期公式計算可知, 理論上鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰肌肉中的休藥期為15d, 皮膚中的休藥期為23d, 肝臟中的休藥期為25d,腎臟中的休藥期為28d。考慮到在實際中內臟往往都會被去除, 故以可食性組織肌肉和皮膚為標準來制定休藥期, 在本試驗條件下, 建議鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰體內的休藥期至少應為23d。